第七章

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及動(dòng)力學(xué)

Operationofbioreactor反應(yīng)器操作1.Batchoperation間歇反應(yīng)Periodsofoperationforbatchoperation1.Batchoperation2.Semi-continuousorfed-batchoperation半連續(xù)操作3.Continuousoperation連續(xù)操作本章主要分析討論間歇培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)這兩種基本方法，然后對(duì)其它培養(yǎng)方法進(jìn)行擴(kuò)展討論。7.1微生物反應(yīng)過程的計(jì)量學(xué)化學(xué)計(jì)量學(xué)：是對(duì)化學(xué)反應(yīng)的組成和化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化程度的數(shù)量化研究。A+BC+D元素平衡法

化學(xué)計(jì)量學(xué)反應(yīng)工程學(xué)反應(yīng)熱力學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)根據(jù)化學(xué)計(jì)量學(xué)，可知有關(guān)反應(yīng)過程中各種反應(yīng)組分的數(shù)量關(guān)系。研究化學(xué)計(jì)量學(xué)的目的是對(duì)反應(yīng)過程進(jìn)行控制和優(yōu)化，爭取獲得最大的經(jīng)濟(jì)收益。

微生物反應(yīng)過程的計(jì)量學(xué)：碳源（多種）+氮源（多種）+無機(jī)鹽（多種）+有機(jī)生長因子（多種）+水+氧氣細(xì)胞+主產(chǎn)物+副產(chǎn)物（多種）+二氧化碳對(duì)于微生物反應(yīng)過程，由于參加反應(yīng)的組分多，代謝途徑錯(cuò)綜復(fù)雜，同時(shí)微生物在生長，并且微生物菌體也不能用摩爾—摩爾的對(duì)應(yīng)關(guān)系表示其計(jì)量關(guān)系。所以要用元素平衡的方法對(duì)微生物反應(yīng)進(jìn)行計(jì)量，將是十分復(fù)雜和困難的。工程上又不能回避這個(gè)問題，每一個(gè)工業(yè)化的微生物反應(yīng)過程都需要計(jì)量。人們提出了一個(gè)相對(duì)簡單的方法，就是引入得率系數(shù)（Yieldcoefficients）的概念，作為描述微生物反應(yīng)中計(jì)量關(guān)系的宏觀參數(shù)。得率系數(shù)有以下幾種定義：1、對(duì)基質(zhì)的細(xì)胞得率Yx/s(Monod提出的)Yx/s==生成細(xì)胞的質(zhì)量消耗基質(zhì)的質(zhì)量△x-△s

在分批培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基的組分在不斷地變化，因此在培養(yǎng)過程中細(xì)胞得率系數(shù)不能視為常數(shù)，在某一瞬時(shí)的細(xì)胞得率稱為微分細(xì)胞得率（或者稱為瞬時(shí)細(xì)胞得率）。分批培養(yǎng)過程，總的細(xì)胞得率為：Yx/s＝x0、s0：反應(yīng)開始時(shí)細(xì)胞和基質(zhì)濃度xt、st：反應(yīng)結(jié)束時(shí)細(xì)胞和基質(zhì)濃度xt-x0s0-st2、對(duì)碳的細(xì)胞得率Yc考慮碳源基質(zhì)時(shí)，無論是需氧還是厭氧培養(yǎng)，宏觀上碳源的一部分被同化為細(xì)胞組成物質(zhì)，其余部分分別被異化、分解為二氧化碳及其它代謝產(chǎn)物。為了表示由碳源同化為細(xì)胞組成物質(zhì)過程的轉(zhuǎn)化效益，采用對(duì)碳的細(xì)胞得率YcYc=

Yc<1

一般在0.4~0.9左右的范圍內(nèi)。生成細(xì)胞量×細(xì)胞含碳量基質(zhì)消耗量×基質(zhì)含碳量3、對(duì)ATP生成的細(xì)胞得率YATP微生物通過基質(zhì)的氧化而獲得細(xì)胞合成、物質(zhì)代謝、物質(zhì)傳遞過程等生命活動(dòng)所必需的能量。但是它并不是利用了基質(zhì)氧化的全部能量，而只有在氧化反應(yīng)中以生成ATP形式獲得自由能，被微生物生命活動(dòng)所利用，其余部分作為反應(yīng)熱釋放到環(huán)境中。據(jù)此，ATP的生成量和細(xì)胞生長量有關(guān)聯(lián)，以異化代謝過程中ATP的生成量作為細(xì)胞得率的基準(zhǔn)。YATP表示為：YATP＝碳源對(duì)菌體的得率消耗1mol碳源由分解代謝產(chǎn)生ATP的摩爾數(shù)根據(jù)大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在厭氧培養(yǎng)時(shí)，YATP值與微生物、基質(zhì)的種類無關(guān)，基本上為常數(shù)，YATP=10YieldcoefficientsBiomass/substrate:Yx/s=-△x/△sProduct/substrate:Yp/s=-△p/△sProduct/biomass:Yp/x=-△p/△x7.2微生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的描述方法

細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)微生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)代謝產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)1、模型的簡化細(xì)胞的生長、繁殖代謝是一個(gè)復(fù)雜的生物化學(xué)過程。該過程既包括細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)，也包括胞內(nèi)與胞外的物質(zhì)交換，還包括胞外的物質(zhì)傳遞及反應(yīng)。該體系具有多相、多組分、非線性的特點(diǎn)。多相指的是體系內(nèi)常含有氣相、液相和固相；多組分是指在培養(yǎng)液中有多種營養(yǎng)成分，有多種代謝產(chǎn)物產(chǎn)生，在細(xì)胞內(nèi)也具有不同生理功能的大、中、小分子化合物；非線性指的是細(xì)胞的代謝通常需用非線性方程來描述。FreshMediaFeedDissolveO2SensorThermocoupleInletAirFlowExitGasFlowAcid/baseAntifoampHSensorLevelSensorAgitatorSparserExitLiquidFlow同時(shí)，細(xì)胞的培養(yǎng)和代謝還是一個(gè)復(fù)雜的群體的生命活動(dòng)，通常每1ml培養(yǎng)液中含有104~108個(gè)細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞都經(jīng)歷著生長、成熟直至衰老的過程，同時(shí)還伴有退化、變異。因此，要對(duì)這樣一個(gè)復(fù)雜的體系進(jìn)行精確的描述幾乎是不可能的。為了工程上的應(yīng)用，首先要進(jìn)行合理的簡化，在簡化的基礎(chǔ)上建立過程的模型。要簡化的內(nèi)容有以下幾點(diǎn)：①微生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是對(duì)細(xì)胞群體的動(dòng)力學(xué)行為進(jìn)行描述。②不考慮細(xì)胞之間的差別(Treatedallcellsasequivalent)，而是取其性質(zhì)上的平均值。（在此基礎(chǔ)上建立的模型稱為非確定論模型Unsegregated）。③在細(xì)胞的生長過程中，細(xì)胞內(nèi)各種成分視為以相同的比例增加，而且忽略環(huán)境的變化對(duì)菌體組成的影響。兩個(gè)概念：均衡生長和非結(jié)構(gòu)模型。在細(xì)胞的生長過程中，如果細(xì)胞內(nèi)各種成分均以相同的比例增加，則稱為均衡生長；那么非均衡生長呢？細(xì)胞生長時(shí)胞內(nèi)各組分增加的比例不同，稱為非均衡生長。結(jié)構(gòu)模型：細(xì)胞的組分是復(fù)雜的，有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、核酸、維生素等，這些成分的含量大小隨環(huán)境條件的變化而變化。如果是在考慮細(xì)胞組成變化的基礎(chǔ)上建立的模型，則稱為結(jié)構(gòu)模型，它能從機(jī)理描述細(xì)胞的動(dòng)態(tài)行為。在結(jié)構(gòu)模型中，一般選取RNA、DNA、糖類及蛋白質(zhì)的含量作為過程的變量，將其表示為細(xì)胞組成的函數(shù)。但是，由于微生物反應(yīng)過程極其復(fù)雜，加上檢測手段的限制，缺乏可直接在線測量的傳感器，給動(dòng)力學(xué)研究帶來了困難，致使結(jié)構(gòu)模型的應(yīng)用受到了限制。如果把菌體視為單組分，則環(huán)境的變化對(duì)菌體組成的影響可被忽略，在此基礎(chǔ)上建立的模型稱為非結(jié)構(gòu)模型。它是在實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，通過物料衡算建立起經(jīng)驗(yàn)或者半經(jīng)驗(yàn)的關(guān)聯(lián)式。Structured-“detailed”intracellulardescriptionUnstructured-“simple”intracellulardescription從模型的簡化考慮一般采用：均衡生長的非結(jié)構(gòu)模型2、反應(yīng)速率的定義

常采用兩種速率概念：絕對(duì)速率和比速率①絕對(duì)速率（又簡稱為速率）細(xì)胞生長率rx=基質(zhì)消耗速率：rs=產(chǎn)物生成速率：

rp=dxdt-dsdtdtdp這些速率的單位：g/L·h②比速率

Specificgrowthrate比生長速率μ=[h-1]基質(zhì)消耗比速率：[h-1]產(chǎn)物生成比速率：[h-1]比速率和細(xì)胞量有關(guān)，比速率的大小反應(yīng)了細(xì)胞活力的大小。dxdt1dxdtx1dxdtx1dsdtx1dsdtSection2.Batchcultureandkinetics分批培養(yǎng)：是指在滅菌后的培養(yǎng)基中，接種微生物（某種），開始在一定的條件下培養(yǎng)微生物，在培養(yǎng)過程中不再向培養(yǎng)基中加入或移去主輔物料（如果是需氧微生物，則需不斷通風(fēng)供氧）的培養(yǎng)方式。分批培養(yǎng)的最大特點(diǎn)是：反應(yīng)體系的微生物濃度和生理狀態(tài)隨培養(yǎng)時(shí)間變化，反應(yīng)體系中的營養(yǎng)成分和代謝產(chǎn)物亦隨培養(yǎng)時(shí)間變化。2.1MicrobialgrowthkineticsMicrobialgrowthkineticsdescribedhowthemicrobegrowthinthefermenter.Thisinformationisimportanttodetermineoptimalbatchtime.MicrobialgrowthkineticsThegrowthofmicrobesinafermentercanbedisassembledintofourstages:-Lagphase-Logphase-Stationaryphase-DeathphaseMicrobialgrowthkineticsLagphase-Thisisthefirstphaseinthefermentationprocess.-Thecellshavejustbeeninjectedintoanewenvironmentandtheyneedsometimetoadjustaccordingly.-Cellgrowthisminimalinthisphase.MicrobialgrowthkineticsLogphase-Thesecondphaseinthefermentationprocess.-Thecellshaveadjustedtotheirenvironmentandarapidgrowthtakeplace.-Cellgrowthrateisthehighestinthisphase.MicrobialgrowthkineticsLogphase-Atsomepoint,thecellgrowthratewillleveloffandbecomeconstant.-Themostlikelycauseofthisleveloffissubstratelimitedinhibition.-Substratelimitedinhibitionmeansthatthemicrobesdonothaveenoughnutrientsinthemediumtocontinuemultiplying.MicrobialgrowthkineticsStationaryphase-Thisisthethirdphaseinthefermentationprocess.-Thecellgrowthratehasleveledoffandbecomeconstant.-Thenumberofcellsmultiplyingequalstothenumberofcellsdying.MicrobialgrowthkineticsDeathphase-Thefourthphaseinthefermentationprocess.-Thenumberofcellsdyingisgreaterthanthenumberofcellsmultiplying.Thecauseofthedeathphaseisusuallythatthecellshaveconsumedmostofthenutrientsinthemedium,andthereisnotenoughnutrientsleftforsustainability.Mediaforindustrialfermentation

Themediaisthefeedsolution-Itmustcontaintheessentialnutrientsneededforthemicrobetogrow.Factorsneedforconsiderationwhenchoosingmedia:-Qualityuniformityandavailability.-Ensuretherearenoproblemswithmediaprepareorotheraspectsofproductionprocess.

Ex.Canemolasses,beetmolasses,cerealgrains.Thedevelopmentofinoculaforindustrialfermentation

Theinoculumisthestarterculturethatisinjectedintothefermenter.-Itmustbeofsufficientsizeforoptimalgrowthkinetics.Sincethefermenterforproductioninindustrialfermentationissolarge,theinoculumvolumhastobequitelarge.-Aseedfermenterisuauallyrequiredtoproducetheinoculum.-Theseedfermenter’spurposeisnottoproduceproduct,buttoproduceinoculum.Aboutlagphase在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中，為了提高生產(chǎn)效率，縮短生產(chǎn)的周期，希望延遲期縮短，要達(dá)到該目的，應(yīng)一般遵循下列規(guī)則：(1)接種的微生物應(yīng)盡可能是高活力的（要用處于指數(shù)期的微生物作種子）。(2)用于培養(yǎng)種子的介質(zhì)和條件應(yīng)盡可能接近生產(chǎn)上使用的發(fā)酵液組成和培養(yǎng)條件。(3)采用大接種量。因細(xì)胞內(nèi)部的某些維生素和輔酶等生長素，向周圍培養(yǎng)液發(fā)生過多的擴(kuò)散，從而降低細(xì)胞的活性，延長延遲期。About