第10章遺傳工程

10.1細胞工程10.2基因工程10.3克隆技術遺傳工程就是人類用近代科學技術的最新成就，在離體條件下進行遺傳操作，按照既定目標，有計劃地改變生物遺傳性，甚至建造新物種的一門學科。廣義的遺傳工程包括細胞工程、染色體工程、基因工程和在此基礎上的克隆技術等幾個方面的內(nèi)容。狹義的遺傳工程則指在分子水平上進行遺傳操作的基因工程。第10章遺傳工程

10.1細胞工程

10.2基因工程10.3克隆技術

10.1細胞工程（cellengineering）應用細胞生物學和分子生物學的理論和方法，按照人們的設計藍圖，在細胞水平上進行遺傳操作及進行大規(guī)模的細胞和組織培養(yǎng)，生產(chǎn)有用的生物產(chǎn)品或產(chǎn)生新的物種或品系。細胞工程學可分為染色體工程、細胞質工程和細胞融合工程等幾個方面。

1.染色體組工程

染色體組工程的主要研究對象是現(xiàn)存染色體組的添加和削減以及新染色體組的合成。

染色體組削減染色體組添加2.染色體工程將某一植物的染色體或染色體片段，按照人們的意愿進行添加、削減和代換，從而達到定向改造植物遺傳性的一項新技術。主要包括染色體的減少、添加以及代換等，但染色體的部分缺失、重復以及倒位、易位等結構變異也包括在內(nèi)。

3.細胞質工程(cytoplasmengineering)

包括細胞質的代換和添加以及細胞器的代換和添加等。

將一個種(或品種)的細胞質用另一個種(或品種)取代，稱為細胞質代換(cytoplasmsubstitution)。（1）回交法

回交法是植物上進行細胞質代換的一個傳統(tǒng)方法。這種方法的缺點是耗時長，而且細胞核不可能百分之百地為另一細胞核取代。（2）核移植法

核移植法是一些動物上常用的方法，即用微量注射器取出一個細胞的核，再注入另一個已除去核的細胞質中，形成一個核和細胞質雜合的細胞。這種方法一般只適用于魚和兩棲類等卵細胞。4.細胞融合（cellfusion）概念：又稱體細胞雜交（somatichybridization），指將不同來源的原生質體（去壁細胞）相融合并使之分化再生，形成新物種或新品種的技術。意義：大大擴大了雜交范圍，使一些用有性雜交方法不能獲得雜種的雜交組合獲得雜種；可以實現(xiàn)父、母本細胞質的融合，這對于由細胞質基因決定的性狀（如雄性不育等）具有重要意義。（1）原生質體培養(yǎng)（2）植物體細胞融合

●化學融合法●電融合法

原生質體（右）原生質體電擊融合電擊融合儀（3）雜種細胞的篩選：如何挑選出融合細胞；如何將異質融合的細胞與同質融合細胞區(qū)分開來。

●營養(yǎng)缺陷互補篩選法●機械篩選法（如不同顏色的原生質體融合）●流式細胞儀篩選法（如不同熒光染料標記）（4）體細胞融合的應用

●創(chuàng)造新品種或新物種（種內(nèi)、種間、屬間雜種）●染色體加倍（體細胞自體融合）●培育核質雜種（先失活處理再融合）●細胞器、染色體的移植植物細胞融合TomatoPotato+Pomato薯茄第10章遺傳工程

10.1細胞工程10.2基因工程10.3克隆技術

10.2基因工程1.基因工程的概念

（1）定義：按照預先設計的生物施工藍圖，采用分子生物學和現(xiàn)代生物技術，對基因進行操縱，以達到定向改變生物的目的。（2）目的：將目的基因引入宿主細胞，并在宿主細胞中整合、表達和傳代，從而創(chuàng)造出新型的生物，如新型微生物，轉基因動物、植物等。施工準備材料,即“目的”基因，載體和工具酶等。把目的基因與載體結合成重組DNA分子。把重組DNA分子引入受體細胞，即基因轉移，建立分子無性繁殖系或稱克隆。鑒定篩選轉基因系，即把目的基因能表達的受體細胞挑選出來。（3）基因工程施工的程序2.載體導入技術

（1）載體

用來運載目的基因的工具稱為載體（vector），常用的載體包括質粒載體和病毒栽體。Ti質粒（Tumourinducingplasmid）致癌農(nóng)桿菌Ach5的Ti質粒結構

Shi、Roi-植物激素合成基因，它們分別對苗和根的生長起抑制作用；Ocs-章魚堿合成基因；Agr-農(nóng)桿堿合成基因；Occ-章魚堿分解代謝基因；Agc-農(nóng)桿堿分解代謝基因；TL、TR-分別表示T-DNA片段的左端和右端；D-毒性區(qū)(或用Vir表示)；Oir-復制起點；Inc-決定Ti質粒間不親合性基因。

T-DNA(轉移DNA)，大約有20kb，在土壤農(nóng)桿菌感染植物細胞之后這個區(qū)域能夠隨機地共價整合到植物染色體DNA中，成為正常的遺傳成分。這個區(qū)域所含的冠癭堿合成酶基因的啟動子，能夠啟動外源基因在植物細胞中表達。但是，這個區(qū)所含的基因還能夠決定腫瘤的形成和抑制植物細胞分化，此外還因為存在多種限制酶的多個切點，造成體外重組DNA操作困難。

因此，Ti質粒在重組DNA的實用技術中往往需要加以改造。目前已經(jīng)以Ti質粒為基礎，構建了許多新的載體。

（2）重組DNA分子的構建

重組DNA（recombinantDNA）分子：外源DNA與載體DNA相連接而形成的DNA分子?！裉烊火ば阅┒饲锌诘南拗菩院怂醿?nèi)切酶分別處理目的基因DNA和載體DNA→粘性末端→堿基互補形成雙鏈→連接酶彌合切口→重組DNA分子。

（3）受體細胞

受體細胞是接受重組DNA分子，目的DNA在其中得以復制擴增、目的基因得以表達產(chǎn)生出正確的表達產(chǎn)物的細胞。受體細胞來源的生物類型要與所使用的載體相互適應。受體細胞要易于培養(yǎng)，適應于大規(guī)模生產(chǎn)或易于再生成完整的生物個體。有時由于特殊的要求而需要選用特定的受體?！荏w選擇：（4）重組DNA分子轉入受體將目的基因的DNA分子連結到載體DNA分子上后，就可以通過它進入到宿主細胞中。轉化（transformation）：以細菌質粒DNA作載體，將外源DNA導入宿主的過程。轉染（transfection）：噬菌體或病毒DNA為載體，將外源DNA片段導入宿主細胞的過程。3.轉基因技術

一個成熟、實用性強的植物轉基因系統(tǒng)應該具備以下條件：

●獲得轉基因植株的效率高；●重復性好；●設備要簡單，易于操作；●由轉化至獲得轉基因植株的時間相對較短；●無基因型的依賴性，即方法的適用范圍廣。

（1）用Ti和Ri質粒進行基因轉移只能侵染雙子葉植物，對于作為重要糧食作物的禾谷類單子葉植物則不能侵染。近年來雖然有關于用農(nóng)桿菌侵染部分禾本科植物獲得成功的報道，但侵染率是很低的，無法在基因轉移中實際應用?！裰亟M質粒構建與增殖●新鮮細菌的培養(yǎng)●受體材料的選擇●接種●愈傷組織誘導●愈傷組織分化成苗●檢測分化植株，以確認是否為真正的轉化苗●對轉化植株進行田間性狀觀察分析▲用Ti和Ri質粒進行基因轉移的步驟：（2）微注射法(microinjection)

操作技術要求嚴格，整個操作必須在一個特制的無菌顯微操作室中進行，而且注射效率低，對受體細胞易造成傷害。所以，現(xiàn)在除了在少數(shù)有條件的實驗室仍采用外，已很少有人在植物基因轉移中使用這種方法，但在動物細胞中仍廣泛使用。通過DNA顯微注射獲得轉基因小鼠

（3）電穿孔法短時間的高壓直流電脈沖的沖擊可以使原生質膜的分子疏松，形成暫時性的小孔(3nm～4nm)，以后可以恢復正常，對原生質體生活力無大影響。存在于原生質體周圍溶液中的外源DNA可以通過這種小孔進入原生質體，實現(xiàn)基因的直接轉移。這種方法轉化效率較高，操作簡便。（4）微束激光打孔法原生質體在短時間微束激光照射下也可在質膜表面形成小孔（約0.25μm2左右），使DNA分子進入細胞。此法與電激穿孔法相比，要求的儀器比較復雜，而且對細胞的傷害較高，若光強度和照射時間掌握不好，形成的小孔無法恢復，原生質內(nèi)容物流出后會引起細胞死亡。（5）基因槍法通過高速飛行的金屬顆粒將包被其外的目的基因直接導人到受體細胞內(nèi)，從而實現(xiàn)轉化。依據(jù)所使用的動力不同分為三類：第一類是以火藥爆炸力作為動力的加速微彈；第二類是以電弧放電蒸發(fā)液滴作為動力；第三類是以高壓氣體作為動力。

除用Ti和Ri質粒進行基因轉移外的其他方法均屬