高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜法檢測人血漿中舒芬太尼濃度

sufenson是第一個(gè)取代苯乙烯n-4位的衍生物。它的化學(xué)和藥理作用在1976年首次報(bào)道。舒芬太尼是一種特異性μ-受體激動(dòng)劑,其鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)、起效時(shí)間短、作用持續(xù)時(shí)間長,而且毒性作用低、安全范圍大,對呼吸和循環(huán)系統(tǒng)影響輕微,在大劑量應(yīng)用舒芬太尼時(shí),亦未出現(xiàn)心肌抑制、心動(dòng)徐緩和外周血管緊張等現(xiàn)象?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)舒芬太尼廣泛地應(yīng)用于心胸外科、神經(jīng)外科、腹部外科等復(fù)雜大手術(shù),作為術(shù)前用藥、神經(jīng)阻滯的輔助藥、麻醉鎮(zhèn)痛藥、誘導(dǎo)麻醉、麻醉維持、術(shù)后鎮(zhèn)痛藥及ICU中重癥患者的鎮(zhèn)靜/鎮(zhèn)痛藥。值得注意的是應(yīng)用舒芬太尼后腦電圖振幅增加、頻率降低,但該現(xiàn)象與舒芬太尼血漿藥物濃度之間是否存在線性關(guān)系還有待于研究,因此有必要對血漿中舒芬太尼的濃度進(jìn)行動(dòng)態(tài)的監(jiān)測。舒芬太尼用量小,血藥濃度低,故對檢測儀器和檢測方法的靈敏度要求高。目前國外有報(bào)道利用液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜法、放免法以及氣相色譜法測定血漿中舒芬太尼的濃度,但是這些方法檢測費(fèi)用高,檢測條件要求苛刻,不能廣泛的應(yīng)用。而國內(nèi)尚無關(guān)于舒芬太尼血漿藥物濃度檢測方法方面的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了測定人血漿中微量舒芬太尼濃度的HPLC法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方法簡單、檢測限低、線性好、靈敏度和精確度高、回收率高、重復(fù)性好,能夠滿足人體藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度研究要求。1材料和試劑1.1sh芬太尼對照品(中國生物制品檢定所提供);丁丙諾啡(中國生物制品檢定所提供)1.2儀器和檢測設(shè)備Waters系列高效液相色譜儀(Empower色譜管理系統(tǒng),2996紫外檢測器,616泵,717自動(dòng)進(jìn)樣器),CAY-1液體快速混合器(北京長安儀器廠),純水儀(密理博公司),離心機(jī)(上海醫(yī)療器械六廠,德國HERMILE公司)。1.3超純水的試劑乙腈為色譜純(Merk公司),磷酸二氫鉀(汕頭市化學(xué)試劑廠),正己烷(天津科密歐化學(xué)試劑公司),無水乙醇(汕頭市化學(xué)試劑廠),氫氧化鈉(天津耀華化學(xué)試劑有限公司),磷酸二氫鉀(天津科密歐化學(xué)試劑廠),水為超純水。2方法和結(jié)果2.1含量測定色譜柱:北京迪馬科技有限公司DiamonsilC18(4.6mm×200mm,5μm),流動(dòng)相為乙腈:0.011mol·L-1KH2PO4緩沖液(35:65,v:v,pH5.6),室溫下測定,流速為1.5mL·min-1,按內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。檢測波長230nm,進(jìn)樣量50μL。2.2磷酸二氫鉀溶液配制精密稱取磷酸二氫鉀2.7218g,置于2L量瓶中,加入蒸餾水定容至刻度,充分溶解,混勻,配制成0.01mol·L-1的磷酸二氫鉀溶液待用。流動(dòng)相為乙腈-0.01mol·L-1KH2P04(35:65,v/v),用3mol·L-1磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至5.6。2.4標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取4mg丁丙諾啡,置于10mL量瓶中,加入甲醇定容至刻度,即得1mg·mL-1內(nèi)標(biāo)的儲(chǔ)備液,用重蒸水將其稀釋至0.2mg·mL-1,4℃冷藏保存,備用。2.5moll-1naoh的制備精取血漿樣本1mL,加入0.2mg·mL-1的丁丙諾啡50μL,旋渦混合10s,再加入250μL0.01mol·L-1NaOH,旋渦混合10s.最后加入3mL正己烷-無水乙醇(19:1,v/v),渦旋5min,3×10g離心10min.靜置10min后,移取上清液2.5mL于10mL塑料離心管中,于35℃水浴上用氮?dú)獯蹈?。?00μL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?渦旋混合3min,移至離心管中,1×10g離心6min取上清液50μL進(jìn)樣。2.6含藥血漿配制精取空白血漿900μL,分別精密加入100μL舒芬太尼標(biāo)準(zhǔn)品的系列濃度,使成12.5,3.125,0.625,0.125,0.03125,0.0078125μg·mL-1的含藥血漿,每種濃度分別配制3份,渦旋混合10s。余下步驟同“血樣處理”項(xiàng)下操作。記錄樣品、內(nèi)標(biāo)峰面積,以樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值A(chǔ)對濃度C作線性回歸,得出回歸方程為:所得方程在0.0078125μg·mL-1至12.5μg·mL-1內(nèi)線性良好。2.7加樣回收率測定精取900μL空白血漿,分別精密加入100μL系列濃度的舒芬太尼對照品溶液,使成12.5,0.625,0.03125μg·mL-1的含藥血漿(n=5),按“血漿樣品的處理方法”項(xiàng)下操作,計(jì)算回收率,結(jié)果見表1。2.8含藥血漿檢測精取900μL空白血漿,分別精密加入100μL系列濃度的舒芬太尼對照品溶液,使成12.5,0.625,0.03125μg·mL-1的含藥血漿(n=5),按“血漿樣品的處理方法”項(xiàng)下操作,每一種濃度1d內(nèi)測定5次和5d內(nèi)測定5次,處理方法同前,得出日內(nèi)變異和日間變異,結(jié)果見表2。2.9凍融法提取樣品-20℃冰箱保存凍存測定:配制低、中、高(12.5,0.625,0.03125μg·mL-1)3種濃度的血漿樣品(n=5),分別于1d,2d,3d,4d,5d融化,提取方法和測定方法同前,結(jié)果表明,5d內(nèi)凍融樣品含量無明顯變化,RSD<15%。2.10結(jié)果舒芬太尼對照品、血漿樣本的色譜圖見圖1,圖中可見樣品峰形良好,與血漿中雜質(zhì)峰分離完全。2.11臨床應(yīng)用4討論2.3不同濃度舒芬太尼精密稱取舒芬太尼對照品25mg,用蒸餾水定容至100mL量瓶中,即得250μg·mL-1對照品儲(chǔ)備液,置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。將對照品?chǔ)備液用蒸餾水依次稀釋成125,31.25,6.25,1.25,0.3125,0.078125μg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)濃度,4℃冷藏保存,備用。經(jīng)患者知情同意后,選擇30例擇期開胸手術(shù)患者,男性,年齡在35～50歲之間,非肥胖病人。手術(shù)全程利用靶控技術(shù)輸入舒芬太尼,開胸前5min設(shè)定舒芬太尼靶濃度為5ng·mL-1。開胸后5min,采靜脈血5mL,離心取上清血漿,利用上述方法測定血漿中的實(shí)際濃度。2.12統(tǒng)計(jì)處理應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,采用單樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.13提取與堿化萃取實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜法檢測到實(shí)際血漿中舒芬太尼的濃度與靶濃度5ng·mL-1之間存在差異,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。4.1國外利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、免疫熒光技術(shù)以及氣相色譜技術(shù)進(jìn)行舒芬太尼血藥濃度的檢測,但是這些方法檢測條件要求苛刻,檢測費(fèi)用高,而且國內(nèi)尚無舒芬太尼血漿藥物濃度檢測的方法學(xué)報(bào)道。本文建立了一種靈敏、準(zhǔn)確的高效液相色譜方法,同時(shí)降低了檢測難度和檢測費(fèi)用。4.2在國外文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,改進(jìn)了實(shí)驗(yàn)提取方法,采用正己烷-無水乙醇進(jìn)行1次萃取,而不是3次萃取,從而簡化了操作,提高了提取回收率,減少了實(shí)驗(yàn)誤差。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明此方法穩(wěn)定、可靠。4.3液-液萃取時(shí)在堿化過程中,我們比較了高濃度堿(2mol·L-1)與低濃度堿(0.5mol·L-1)對檢出結(jié)果的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度堿降低提取回