胞吐的分子機制

異基因（異基因）是指在真核細胞中，含有物質(zhì)的膜袋泡與物質(zhì)膜融合，并將其從細胞外排出的過程。一般有組成型(constitutivepathway)和調(diào)節(jié)型(regulatedpathway)兩種途徑。前者見于所有的真核細胞的膜結(jié)構(gòu),如質(zhì)膜的正常更新,此時運輸小泡(transportvesicle)持續(xù)不斷地從高爾基網(wǎng)形成,到達質(zhì)膜后立即進行胞吐;此過程不需外部信號的觸發(fā)。除這一途徑外,很多細胞(如內(nèi)分泌細胞、外分泌細胞、肥大細胞、血小板及神經(jīng)元等)還具有調(diào)節(jié)型途徑:分泌囊泡(secretoryvesicle)成群地聚集在質(zhì)膜下,只有在外部信號觸發(fā)質(zhì)膜產(chǎn)生胞內(nèi)信使后才和質(zhì)膜融合發(fā)生胞吐。胞內(nèi)信使如何觸發(fā)胞吐目前尚不清楚,而且觸發(fā)因子隨細胞類型而異。如在神經(jīng)元和卵細胞,[Ca2+]i的升高足以觸發(fā)胞吐;而在肥大細胞,Ca2+則僅是胞吐的輔助因子。另外,不同細胞的融合機制不同。胞吐的分子機制是近幾年研究的熱點,但與胞吐有關(guān)的關(guān)鍵分子至今尚未確定。本文擬就和神經(jīng)分泌有關(guān)的三個方面的進展作一介紹。一、胞吐和表型的缺失有些研究表明,調(diào)節(jié)型胞吐的激活和以肌動蛋白為基礎(chǔ)的末梢細胞骨架的快速重組有關(guān)。這提示胞吐可能是由融合屏障的撤除而被觸發(fā)的。融合屏障可為分泌囊泡和質(zhì)膜間的細胞骨架蛋白凝膠網(wǎng)。除肌動蛋白外,基質(zhì)蛋白可隨細胞而異。(一)tkisynapsin蛋白表達動力學(xué)synapsins是指存在于SSVs膜上的一族外周磷蛋白,可能是使SSVs彼此之間及與細胞骨架交聯(lián)?，F(xiàn)已知道這個家族包含四個成員:synapsinⅠa、Ⅰb及Ⅱa、Ⅱb。Ⅰa和Ⅰb是同一基因的不同加工產(chǎn)物。對synapsins的生化及功能性質(zhì)的了解大多來自對synapsinⅠ的研究,已知它至少包含四種不同蛋白激酶的磷酸化位點。利用快速冰凍蝕刻技術(shù),Hirokawo等(1990)已確定了突觸前活性區(qū)(activezone)的構(gòu)筑模型:囊泡之間及與肌動蛋白網(wǎng)之間似乎是通過30nm粗的短鏈分子相連的;肌動蛋白網(wǎng)則通過fodrin和活性區(qū)相聯(lián)。該短鏈分子在外表及大小上與synapsinⅠ很相似,提示synapsin尾部和囊泡結(jié)合,而頭部和肌動蛋白或另一synapsin的頭部結(jié)合,從而使小泡相互交聯(lián)。這種交聯(lián)將囊泡固定在釋放位點附近。鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/CMkinaseⅡ)對synapsinⅠ的磷酸化可能降低囊泡與肌動蛋白的結(jié)合,從而使囊泡掙脫細胞骨架網(wǎng)而到達活性區(qū)進行胞吐。由于遞質(zhì)釋放是一個非?？斓倪^程,所以,這一機制似乎不參與遞質(zhì)釋放的直接控制,但也許在為下次刺激準(zhǔn)備可能胞吐的囊泡上有重要作用。將synapsinⅠ或Ca2+/CMkinaseⅡ注入烏賊大纖維軸突的實驗支持這一假說,即synapsinⅠ的磷酸化狀態(tài)參與遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)。(二)嗜鉻細胞的calpacin和磷酸化嗜鉻細胞質(zhì)膜下有高度有序的細胞骨架網(wǎng),包括肌動蛋白、fodrin、caldesmon及紐蛋白(vinculin),可能作為胞吐屏障。受刺激后[Ca2+]i的升高將導(dǎo)致嗜鉻顆粒從該網(wǎng)掙脫,到達質(zhì)膜胞吐位點進行胞吐。有幾個鈣結(jié)合蛋白與此有關(guān),其中最重要的可能是calpactin。它屬于annexins家族,由兩條重鏈(36kD)及兩條輕鏈(10kD)組成,在進化上保守。在完整的嗜鉻細胞中,它位于質(zhì)膜和嗜鉻顆粒的胞質(zhì)面,細胞受刺激胞吐時,它可被磷酸化。體外實驗表明,它可促進花生四烯酸對膜的融合?？赏ㄍ傅?參見下文)嗜鉻細胞由于胞吐所需組分的泄漏,分泌水平降低,但可被calpactin或其輕鏈(p36)恢復(fù);而這一效應(yīng)又可被p36抗體阻斷(Ali等.1989)。另外,calpactin引起嗜鉻顆粒聚集所需的鈣濃度最接近生理水平,所以,calpactin或p36可能是嗜鉻細胞胞吐時的鈣受體并參與胞吐的觸發(fā)。二、免疫活性化合物的變化許多細胞的胞吐過程涉及G蛋白。對可通透細胞(permeabilizedcell,即利用去垢劑或成孔毒素等在細胞膜上造成大小不同的孔,從而可向胞內(nèi)導(dǎo)入特定的離子、核苷酸等)胞吐調(diào)節(jié)因子的研究提示,可能有一種新的G蛋白參與胞吐過程。已知肥大細胞在受IgE刺激后釋放組胺是通過磷脂酶C(PLC)-第二信使系統(tǒng)實現(xiàn)的。經(jīng)鏈球菌溶血素-O(streptolysin-O,SL-O)處理的可通透肥大細胞,供給Ca2+(μmol/L)及GTP(μmol/L)后,可使組胺(100D)釋放。但是,用新霉素(neomycin)將PLC完全抑制后,供給GTP及Ca2+仍可使組胺釋放。這一結(jié)果提示,在胞吐中至少有兩步涉及GTP:(1)由和受體偶聯(lián)的G蛋白(GP)激活PLC,從而使4,5-二磷酸酯酰肌醇(PIP2)水解成1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)和二酯酰甘油(DG);(2)除GP外必還存在另一GTP作用位點,在隨后的胞吐級聯(lián)反應(yīng)中起作用。Cockcroft等把這一后來起作用的G蛋白命名為GE(附圖)。嗜中性粒細胞釋放組胺過程與此相似,不過只要供給GTP即可,Ca2+非必需(Barrowman等.1986)?？赡苌婕癎E的其它細胞還有HC-60細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鉻細胞及胰島素分泌細胞。最近,已有幾個實驗室報道在分泌顆粒及突觸囊泡上發(fā)現(xiàn)了G蛋白。(1)嗜鉻細胞分泌顆粒膜及質(zhì)膜上存在三種百日咳毒素(PTX)底物,分子量分別為39、40、及41kD(Toutant等.1987);(2)人嗜中性粒細胞分泌顆粒上存在PTX底物,免疫上與Gix相關(guān)(Retrosen等.1988);(3)海鲼電器官膽堿能突觸囊泡膜上存在PTX敏感、分子量為37～41kD的G蛋白(Ngsee等.1990)。但是它們在胞吐中的作用尚不清楚。Bourne(1988)認為,p21ras超基因家族中的低分子量的小G蛋白(smallGTP-bindingprotein)可能與囊泡和質(zhì)膜融合前的運輸及識別有關(guān)。在酵母,編碼小G蛋白的sec4基因若發(fā)生突變,則囊泡不能定位到質(zhì)膜并與之融合(Salminen.1986)。另外,已有證據(jù)表明,ras原癌基因本身可能參與囊泡運輸過程。將純化的H-ras蛋白注入成纖維細胞將導(dǎo)致顯著的胞飲(Bar-Sagi等.1986);相反,注入肥大細胞,則導(dǎo)致大量的脫粒(Bar-Sagl等.1988)。利用α32P-GTP超載技術(shù)及ADP-核糖基化檢定方法,現(xiàn)已純化了20多種和分泌囊泡膜緊密相連的小G蛋白(20～25kD)。最近,又發(fā)現(xiàn)通過阻斷胞吐從而阻斷突觸傳遞的毒素可使G蛋白ADP-核糖基化(Matsuoka等.1989),提示小G蛋白可能參與SSVs的胞吐。Fischer等(1990)已在SSVs膜上發(fā)現(xiàn)一種神經(jīng)元特異的小G蛋白——rab3A。至于GE是屬于低分子量的小G蛋白,還是高分子量的G蛋白還有待于進一步的研究。三、中膜融合可能機制之一是短暫合并孔模型(一)孔道融合型質(zhì)膜的提出(1)致密性的疏水蛋白插入并列的質(zhì)膜和囊泡膜中,形成橋樣中間結(jié)構(gòu),這樣,相對的膜片層的磷脂可跨行,從而導(dǎo)致融合;(2)在兩膜相鄰處,磷脂修飾酶使磷脂親水區(qū)變?yōu)槭杷畮亩鴮?dǎo)致膜的局部融合;(3)通過囊泡的滲透腫脹(osmoticswelling)拉展質(zhì)膜,從而使疏水?；湵┞?這三種機制均將導(dǎo)致不可逆的胞吐過程,囊泡膜將會整個地徹底并入質(zhì)膜;(4)由囊泡膜中的多亞基蛋白和質(zhì)膜中相似的蛋白形成類縫管連接的括約孔道(“gap-junction-like”sphincter)。在這種情況下,釋放將由一個“可逆”的融合介導(dǎo):受刺激時,孔瞬時開放,釋放出囊泡內(nèi)含物,接著很快關(guān)閉;在高頻刺激下,這些縫管連接的形成也許會導(dǎo)致膜融合,并通過孔的不斷擴大,從而導(dǎo)致囊泡膜徹底并入質(zhì)膜。最近,模型(4)在肥大細胞胞吐的研究中得到了支持。每次胞吐發(fā)生時,由于囊泡膜并入質(zhì)膜,使質(zhì)膜表面積增加,從而導(dǎo)致質(zhì)膜電容的增加,這樣便可通過測量質(zhì)膜電容來監(jiān)視胞吐過程。當(dāng)胞吐慢到每秒只涉及幾個囊泡時,膜電容將會以階梯(step)的形式增加,每個階梯對應(yīng)于一個囊泡的胞吐。Beige小鼠的肥大細胞僅含10～40個巨大囊泡(直徑為1～5μm),因而由于它們的同時融合而造成的膜電容增加的重迭可能性極小,而呈階梯性增加的可能性極大。Breckenridge及Almers(1987)觀察到融合過程分為兩步:最初可測到一個瞬態(tài)的初始電流成份,說明融合孔的形成,這一過程是可逆的(因這一電流忽隱忽現(xiàn))?？椎碾妼?dǎo)為230pS,這和縫管連接以及由SSVs的主要膜蛋白synaptophysin所形成的通道的電導(dǎo)相似(Thomas等.1988);然后,幾毫秒后,電導(dǎo)明顯增加,表明孔在擴大,作為融合的結(jié)束標(biāo)志可觀察到滲透腫脹現(xiàn)象。盡管尚無直接的形態(tài)學(xué)證據(jù),但這一結(jié)果在神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域引起了人們的很大興趣,因為這意味著synaptophysin可能是融合蛋白的候選者(見下文)。另外,融合孔可進行部分的胞吐而使小遞質(zhì)分子釋放,則可解釋為何在適度刺激時,SSVs的膜組分不和突觸前膜組分互混。但是,由于分辨率等技術(shù)上的限制,目前尚不能對快速的遞質(zhì)釋放的胞吐過程進行類似的研究。(二)a/b端分子融合蛋白的候選者分子量為38kD,故又名p38,是許多神經(jīng)元及一些內(nèi)分泌細胞囊泡上的主要膜蛋白。氨基酸順序分析表明,它具有四個跨膜區(qū)域,分子的兩端位于胞質(zhì)面,N端是糖基化的,C端可和Ca2+(μmol/L)結(jié)合,并可被內(nèi)源及外源性酪氨酸激酶磷酸化。人工膜重組實驗表明,它可在人工膜上形成電壓依賴性通道,電導(dǎo)為150pS。雖然這些發(fā)現(xiàn)的重要性還有待于進一步闡明,但結(jié)構(gòu)上與縫管連接的構(gòu)成單位connexin的相似性(指具相同的疏水和親水片段順序,非氨基酸順序),提示它也許在胞吐過程中融合孔的初始形成中扮演角色。另外,融合蛋白的候選者還有N-乙基順丁烯二酰亞胺敏感因子(NSF)及annexins家族的synexin.(三)胞外高滲情況在很多系統(tǒng),如海膽卵的脫粒等,滲