生物醫(yī)學儀器分析與應用Ⅰ實驗報告樊繼強14S028014目錄TOC\o"1-3"\h\u3992前言 320294實驗一、如何在細胞培養(yǎng)室中規(guī)范操作、細胞培養(yǎng)的基本操作方法 417433一、實驗目的 4647二、實驗原理 415963三、實驗方法 4169451、貼壁細胞培養(yǎng)方法 4314012、懸浮細胞培養(yǎng)方法 51921四、注意事項 530635實驗二、顯微鏡、多功能酶標儀、紫外可見酶標儀的操作 63976一、實驗目的 613358二、實驗原理 697391、正、倒置熒光顯微鏡 6275752、多功能酶標儀 6227461、正置顯微鏡操作 6264152、倒置熒光顯微鏡操作 7190483、多功能酶標儀 81985四、實驗結(jié)果 89621五、注意事項 8270561、正、倒置熒光顯微鏡 899952、多功能酶標儀 927296實驗三、各種類型高速離心機的使用及動物飼養(yǎng)室的操作 1020289一、實驗目的 1028699二、實驗原理 1027499三、實驗內(nèi)容 1012494四、注意事項 112017離心機注意事項 1125956動物房注意事項 1123379實驗四、接觸角測試儀、動態(tài)光散射激光粒度與電位分析儀的使用及常用光譜分析技術(shù)與儀器操作 1322620一、實驗目的 1314678二、實驗原理 13247211.接觸角測試儀原理 13254302.動態(tài)光散射的基本原理 14114803.光譜分析原理 1526961三、實驗內(nèi)容 18321571.接觸角測試儀操作方法 18259852.激光粒度儀的操作方法 18311463.光譜分析各儀器操作方法 1927424四、注意事項 2263051.接觸角測試儀注意事項 22100862.動態(tài)光散射的注意事項 2277903.光譜分析各儀器注意事項 2321443實驗五、二維電泳系統(tǒng)、快速高效蛋白純化工作站及實時熒光定量PCR儀的使用 2519106一、實驗目的 2532598二、實驗原理 25234091.二維電泳系統(tǒng)工作原理 25251322.快速高效蛋白純化工作站工作原理 2581353.實時熒光定量PCR工作原理 2618626三、實驗內(nèi)容 27253091.二維電泳系統(tǒng)操作方法 27261352.快速高效蛋白純化工作站操作方法 28301383.實時熒光定量PCR操作方法 294369四、注意事項 31239931.二維電泳系統(tǒng)注意事項 31254482.快速高效蛋白純化工作站注意事項 31308093.實時熒光定量PCR注意事項 3119639實驗總結(jié) 32前言本次生物醫(yī)學儀器分析與應用Ⅰ課程實驗共五個，包括：如何規(guī)范在細胞培養(yǎng)室中操作、熒光顯微鏡的操作及酶標儀的使用、高速離心機的使用及如何動物房中規(guī)范操作、接觸角測試儀、動態(tài)光散射激光粒度與電位分析儀的使用及常用光譜分析技術(shù)與儀器操作、二維電泳系統(tǒng)和快速高效蛋白純化工作站及實時熒光定量PCR儀的使用。本門課程實驗是在哈工大科學院2E棟完成的，指導老師分別為韓鳳桐、岳磊、張垚、張楠曦、曲有鵬。非常感謝五位老師在本學期給予我們的細致生動的教學，經(jīng)過這次的生物醫(yī)學儀器分析與應用Ⅰ課程實驗,我個人得到了不少的收獲,一方面加深了我對儀器使用理論知識的認識,另一方面也提高了實驗操作能力。實驗一、如何在細胞培養(yǎng)室中規(guī)范操作、細胞培養(yǎng)的基本操作方法實驗時間：2014年11月26日實驗地點：科學園2E棟111室指導老師：韓鳳桐一、實驗目的了解細胞培養(yǎng)室的使用規(guī)則，掌握細胞傳代和細胞培養(yǎng)的基本知識。二、實驗原理細胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代(繼代)培養(yǎng)。直接從體內(nèi)獲取的組織細胞進行首次培養(yǎng)為原代培養(yǎng)；當原代培養(yǎng)的細胞增殖達到一定密度后，則需要做再培養(yǎng)，即將培養(yǎng)的細胞分散后，從一個容器以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移到另一個或幾個容器中擴大培養(yǎng)，為傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)就是細胞的代數(shù)。細胞培養(yǎng)是一種程序復雜、要求條件多而嚴格的實驗性工作。所有離體細胞的生長都受溫度、滲透壓、pH值、無機鹽影響，消毒、配液等均有嚴格的規(guī)范和要求，特別是無菌操作是細胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。三、實驗方法1、貼壁細胞培養(yǎng)方法37℃水浴鍋內(nèi)預熱培養(yǎng)液、PBS，室溫下預熱胰酶（胰蛋白酶液）。實驗前，無菌操作臺需用紫外燈照射15-30分鐘滅菌。用75％酒精擦拭雙手，點燃酒精燈，取出細胞。小心吸（倒）出舊培養(yǎng)液，再加入PBS洗掉殘留的培養(yǎng)液。加入適量胰蛋白酶液消化細胞（細胞變圓，可以吹打下來即可終止消化，以免消化過度，影響細胞生長），用培養(yǎng)液終止消化反應。吹打制成細胞懸液，吸入離心管中，800轉(zhuǎn)/分鐘離心5min。棄上清液，加入PBS，吹打清洗細胞，800轉(zhuǎn)/分鐘離心5min。棄上清液，加入新培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液。將細胞懸液吸出分裝至新培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基并適當旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗后清理實驗垃圾，并用1‰新潔爾滅水擦拭超凈臺。2、懸浮細胞培養(yǎng)方法37℃水浴鍋內(nèi)預熱培養(yǎng)液、PBS。實驗前，無菌操作臺需用紫外燈照射15-30分鐘滅菌。用75％酒精擦拭雙手，點燃酒精燈，取出細胞。將細胞懸浮液搖勻，吸出一定量分裝至新培養(yǎng)瓶中，再分別補充適量培養(yǎng)液，旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗后清理實驗垃圾，并用1‰新潔爾滅水擦拭超凈臺。四、注意事項本實驗室為特殊潔凈室，未登記使用者或與未經(jīng)實驗中心管理人員許可者請勿入內(nèi)。進入細胞室工作人員必須登記，將姓名、聯(lián)系方式等信息填寫在培養(yǎng)室門上表格內(nèi)，必要時便于聯(lián)系。細胞培養(yǎng)工作人員固定在各自培養(yǎng)室內(nèi)工作，禁止隨意更換培養(yǎng)室。進入細胞培養(yǎng)室工作，必須更換細胞室內(nèi)的白服和拖鞋，必須經(jīng)過風淋消除衣服和皮膚表面灰塵和微生物，進出細胞培養(yǎng)室關(guān)好風淋室門，長發(fā)的同學請束發(fā)。禁止將離心配平的液體倒入水浴鍋，避免水浴鍋水污染。做完實驗必須及時清理超凈臺和實驗室邊臺，保持超凈臺和培養(yǎng)室的整潔。及時清理實驗過程中的垃圾，按要求分類處理回收的培養(yǎng)瓶，不能把垃圾留給洗刷老師，不清理垃圾者罰每天早上清理細胞室垃圾１個月。離開培養(yǎng)室必須將白服掛好，將拖鞋擺放整齊。夜晚，最后離開細胞培養(yǎng)室的人員，關(guān)閉細胞室內(nèi)的照明和滅菌燈，夏季，最后離開者關(guān)閉培養(yǎng)室內(nèi)的空調(diào)。必須按時參加細胞室衛(wèi)生打掃工作，多次逃避勞動者禁止進入細胞室工作。實驗二、顯微鏡、多功能酶標儀、紫外可見酶標儀的操作實驗時間：2014年12月3日實驗地點：科學園2E棟117室指導老師：岳磊一、實驗目的了解倒置熒光顯微鏡及酶標儀的工作原理；掌握儀器的使用方法；了解操作中的注意事項；二、實驗原理1、正、倒置熒光顯微鏡熒光顯微鏡是利用一個高發(fā)光效率的點光源，經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光作為激發(fā)光、激發(fā)標本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進行觀察。這樣在強烈的對襯背景下即使熒光很微弱也易辨認，敏感性高，熒光光源—一般采用超高壓汞燈（50-200W），它可發(fā)出各種波長的光，但每種熒光物質(zhì)都有一個產(chǎn)生最強熒光的激發(fā)光波長，所以需家用激發(fā)濾片（一般有紫外、紫色、藍色和綠色激發(fā)濾片），僅使一定波長的激發(fā)光透過照射到標本上，而將其他光都吸收掉。沒種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在極短時間內(nèi)發(fā)射出較照射波長更長的可見熒光。2、多功能酶標儀光源燈發(fā)出的光波經(jīng)過濾光片或單色器變成一束單色光，進入塑料微孔極中的待測標本。該單色光一部分被標本吸收，另一部分則透過標本照射到光電檢測器上，光電檢測器將這一待測標本不同而強弱不同的光信號轉(zhuǎn)換成相應的電信號。電信號經(jīng)前置放大，對數(shù)放大，模數(shù)轉(zhuǎn)換等信號處理后送入微處理器經(jīng)行數(shù)據(jù)處理和計算，最后由顯示器和打印機顯示結(jié)果。三、實驗方法1、正置顯微鏡操作移去顯微鏡防護罩，檢查顯微鏡鏡頭和濾光片，打開光源；如需使用熒光，打開汞燈電源開關(guān)，稍后片刻，觀察“BURNERON”指示燈亮并伴隨“啪嗒”一聲則顯示汞燈開啟正常；放好標本，在可見光下(熒光選擇撥盤位于1-BF)調(diào)節(jié)顯微鏡，選擇好放大倍數(shù)并調(diào)節(jié)好焦距，找到合適的視野；觀察熒光標本，確認SHUTTER處于ON的位置，根據(jù)需要選擇合適的濾過片(2-SWB:510nm以上;3-SWG:550nm以上)；開啟電腦電源；將顯微鏡光路選擇調(diào)節(jié)鈕推至拍攝檔；雙擊電腦桌面圖標“DPController”開啟拍攝軟件；在Capture選項卡中點擊預覽按鈕進行觀察和參數(shù)調(diào)整，確認后點擊拍攝按鈕進行拍攝，拍攝過程請避免操作臺震動；如果需要添加標尺，請在Scale選項卡中開啟并選擇相應的放大倍數(shù)；拍攝后，照片管理器DPManager將自動開啟，在此處選擇對照片進行加工或保存；使用結(jié)束后關(guān)閉汞燈電源，待汞燈冷卻后方可蓋上顯微鏡防護罩。用移動設備取走需要的圖片，關(guān)閉電腦。2、倒置熒光顯微鏡操作移去顯微鏡防護罩，檢測顯微鏡鏡頭和濾光片，打開光源：單純使用相差顯微鏡觀察時，在電壓調(diào)節(jié)旋鈕處于最小狀態(tài)是打開TH4-200電源開關(guān)，然后按顯示鏡正面下方的電源按鈕，指示燈亮即可使用。使用其右上方的電壓旋鈕可以調(diào)節(jié)亮度。使用后將電壓旋鈕調(diào)到最低，再關(guān)閉電源；使物鏡與光學組件選擇環(huán)匹配：如需使用熒光，打開汞燈電源開關(guān)，稍等片刻，觀察“BURNERON”指示燈亮并伴隨”啪嗒“一聲則顯示汞燈開啟正常；放好標本，在可見光下調(diào)節(jié)顯微鏡，選擇好放大倍數(shù)并調(diào)節(jié)好焦距，找到合適的視野；觀察熒光標本，確認SHUTTER處于ON的位置，旋轉(zhuǎn)熒光激發(fā)塊選擇盤，選擇所需熒光組件；開啟電腦電源；將顯微鏡光路選擇調(diào)節(jié)鈕推至拍攝檔；雙擊電腦桌面圖標“DPController”開啟拍攝軟件；在Capture選擇卡中點擊預覽按鈕經(jīng)行觀察和參數(shù)調(diào)整，確認后點擊拍攝鈕進行拍攝，拍攝過程中請避免操作臺震動；如需要添加標尺，請在Scale選擇卡中開啟并選擇相應的放大倍數(shù)；拍攝后，照片管理器DPManager將自動開啟，在此處選擇對照片進行加工或保存；使用結(jié)束后關(guān)閉汞燈電源，待汞燈冷卻后方可蓋上顯微鏡防護罩；用移動設備取走需要的圖片，關(guān)閉電腦。3、多功能酶標儀 1）打開主電源，然后打開機器電源，預熱5分鐘以上，打開電腦，運行Gene5軟件，或者打開一個設計好的程序；2）設置激發(fā)光波長、發(fā)射光波長、濾鏡位置、檢測靈敏度和光源；3）布板，排列樣品孔和標準孔的位置濃度；4）讀板，輸入相關(guān)的信息后點擊Read，開始讀板；5）將當前看到的數(shù)據(jù)結(jié)果直接導入到Excel表格中；6）保存數(shù)據(jù)，使用移動設備取走需要的結(jié)果，關(guān)閉電腦和機器。四、實驗結(jié)果倒置熒光顯微鏡拍照結(jié)果：五、注意事項1、正、倒置熒光顯微鏡使用前請登記使用人、用途和使用機時，如果使用熒光請登記汞燈開啟時間；按照熒光顯微鏡操作規(guī)程要求進行操作，不要隨意改變程序及機器其它旋鈕；調(diào)節(jié)時從低倍至高倍進行，焦距調(diào)節(jié)先粗后細；不要污染物鏡鏡頭。一旦污染，先用擦鏡紙擦除一遍，再用顯微鏡專用擦洗液擦洗，最后用鏡紙再擦一遍。本機器100X物鏡為油鏡，使用油鏡鏡頭后，先用顯微鏡專用擦洗液擦洗，最后用鏡紙再擦一遍；汞燈開啟后15分鐘內(nèi)不得關(guān)閉，關(guān)閉后30分鐘內(nèi)不得重啟，一天中應避免數(shù)次點燃光源；汞燈高溫，請勿用手直接觸摸，請勿覆蓋汞燈排氣口；盡可能縮短熒光觀察時間，每次以1～2h為宜，不要直接觀察激發(fā)光源，保護眼睛；關(guān)閉顯微鏡電源前，先把光源調(diào)到最低，離開時請檢查記錄，關(guān)閉所有電源，清理操作臺和房間；本計算機不保證數(shù)據(jù)的安全，拍攝圖片請自行及時取走；發(fā)現(xiàn)異常情況請及時報告負責老師，不要自行處理。2、多功能酶標儀1）使用前請登記使用人、用途和使用機時；2）不要反復開關(guān)機器，如果一天要間隔多次測定，不用關(guān)閉機器：3）機器打開后至少預熱5分鐘；4）本計算機不保證數(shù)據(jù)的安全，及時考取數(shù)據(jù)；5）發(fā)現(xiàn)異常情況請及時報告負責老師，不要自行處理。實驗三、各種類型高速離心機的使用及動物飼養(yǎng)室的操作實驗時間：2014年12月10日實驗地點：科學園2E棟118室指導老師：張垚一、實驗目的了解高速離心機的工作原理；掌握儀器及動物房的使用方法；了解操作中的注意事項；二、實驗原理 高速離心機工作原理：離心機是利用離心力加快液體中顆粒的沉降速度，把樣品中不同沉降系數(shù)和浮力密度的物質(zhì)分離和沉淀的一種專用儀器。三、實驗內(nèi)容高速離心機操作方法：按順序選擇ROTORID（轉(zhuǎn)子）－選擇轉(zhuǎn)子型號SPEED--RPM（轉(zhuǎn)速）/RCF（離心力）－輸入所需轉(zhuǎn)速或離心力TIME（時間）－輸入離心所需時間TEMP（溫度）－輸入離心所需溫度關(guān)閉艙門后，指示燈亮起表示艙門關(guān)閉正常按START（開始）--開始離心離心中禁止修改ROTOR（轉(zhuǎn)子）型號離心中可以修改RPM（轉(zhuǎn)速）TIME（時間）TEMP（溫度）離心結(jié)束后，SPEED（轉(zhuǎn)速指示）為0表示艙門可以打開。離心后應將轉(zhuǎn)子取出，將離心艙擦拭干凈。動物房的使用：使用動物房的人員每天操作時間（上午07：00至下午19：00），盡量避免超時操作，以免影響動物生活規(guī)律。使用動物房的人員每天工作任務：1加水及清洗水瓶：水瓶內(nèi)的水位<1/3時要及時填滿。2加飼料：每天固定一個時間進行添加飼料。3換墊料：每個鼠籠每三天更換一次墊料。4清洗鼠籠和水瓶：換墊料后的鼠籠必須洗刷干凈后晾干方可使用；在添水時發(fā)現(xiàn)水瓶內(nèi)有污濁，必須單獨清洗。每周必須清洗一次水瓶。5打掃室內(nèi)衛(wèi)生：每個人使用后必須打掃動物房內(nèi)衛(wèi)生，做到及時清理，不影響他人使用。每周使用消毒液進行兩次消毒。6倒垃圾：使用結(jié)束后倒掉垃圾。7檢查小鼠：每天檢查一次所有小鼠籠內(nèi)是否有死鼠，如有應及時取出。8每批實驗結(jié)束后，應將籠具清洗并高壓滅菌后再使用。四、注意事項離心機注意事項離心前必須要配平（天平稱量），將樣品倒入離心管后連同離心管蓋子一起置托盤天平中左右嚴格平衡后才能放入轉(zhuǎn)子的對稱孔內(nèi)（注意一定對稱放置?。┥w好離心管蓋子（離心管只能八成滿，以防太滿而外溢），若樣品管為奇數(shù)管可用蒸餾水作平衡管。定期使用潤滑油保養(yǎng)軸，使用真空脂保養(yǎng)O-Ring。動物房注意事項小鼠換籠時，一定不要將原鼠籠上的標簽和位置弄混，否則后果不堪設想。教師和研究生主要負責自己小鼠的實驗和繁殖（如有需要），平時也應多多照顧自己的小鼠。在對小鼠進行試驗期間，必須提前告知工作人員，否則容易影響實驗結(jié)果。清洗鼠盒及水瓶時應使用軟質(zhì)毛刷，不得使用有機溶劑如：酒精。如因違規(guī)操作，致籠具損壞，應賠償。因?qū)嶒灝a(chǎn)生廢棄物，應帶回各自實驗室處理，不得將注射器、手術(shù)刀片等丟入垃圾袋。動物殘體直接裝入冰箱內(nèi)的袋子收集，不得用手套、報紙、塑料袋等物品包裹。使用IVC籠具時應注意回風壓力，防止因取出大量籠具或回風管堵塞，造成籠具通風不暢，影響動物健康。洗刷籠具時必須將籠具內(nèi)殘余墊料清理干凈，以防堵塞下水道。實驗四、接觸角測試儀、動態(tài)光散射激光粒度與電位分析儀的使用及常用光譜分析技術(shù)與儀器操作實驗時間：2014年12月17日實驗地點：科學園2E棟116室指導老師：張楠曦一、實驗目的了解各儀器的工作原理；掌握各個儀器的使用方法；了解操作中的注意事項；二、實驗原理1.接觸角測試儀原理接觸角（contactangle）又稱潤濕角（wettingangle），是指自氣、液、固三相交點處所作的氣—液界面切線，經(jīng)液體內(nèi)部到達液體界面后與固—液界面交界線所形成的夾角“θ”（fig.1），是用于表征表面張力與潤濕度的基本物理量。潤濕又稱浸潤（wetting）是指固體表面一種流體被另一種流體取代的過程。潤濕度（wettability）則用來度量一種流體被另一種流體取代過程的難易。接觸角越大，意味著液體的浸潤性越差，潤濕度越差；接觸角越小，意味著液體的浸潤性越強，潤濕度就越好。接觸角潤濕程度θ=0°完全潤濕能潤濕0＜θ﹤90°部分潤濕（有限潤濕）θ=90°潤濕與否的分界線180＞θ﹥90°不潤濕（不良潤濕）不能潤濕θ=180°完全不潤濕表一.接觸角與潤濕程度Table.1Contactanglesandwettability當接觸角為0°時，液體對固體“完全潤濕”，液體將在固體表面上完全展開；當接觸角為180°時，液體對固體“完全不潤濕”，當液體量很少時則在固體表面上縮成一個圓球（表一，圖二）。2.動態(tài)光散射的基本原理光通過膠體時，粒子會將光散射，在一定角度下可以檢測到光信號，所檢測到的信號是多個散射光子疊加后的結(jié)果，具有統(tǒng)計意義（圖三）。圖三.大顆粒和小粒子的相關(guān)關(guān)系函數(shù)瞬間光強不是固定值，在某一平均值下波動，但波動振幅與粒子粒徑有關(guān)。正在做布朗運動的粒子速度，與粒徑（粒子大?。┫嚓P(guān)。大顆粒運動緩慢，小粒子運動快速。如果測量大顆粒，那么由于它們運動緩慢，散射光斑的強度也將緩慢波動。類似地，如果測量小粒子，那么由于它們運動快速，散射光斑的密度也將快速波動。圖二顯示了大顆粒和小粒子的相關(guān)關(guān)系函數(shù)?？梢钥吹?，相關(guān)關(guān)系函數(shù)衰減的速度與粒徑相關(guān)，小粒子的衰減速度大大快于大顆粒的。最后通過光強波動變化和光強相關(guān)函數(shù)計算出粒徑及其分布。Zeta電位測試的基本原理：外加電場的影響下，分散在液體中的帶電顆粒相對于液體的運動，發(fā)生電泳現(xiàn)象，而電泳產(chǎn)生的原因是由于分散系的微粒表面形成擴散雙電層，雙電層的滑動面上產(chǎn)生電動電位（Zeta電位）。電位與電泳速度有關(guān)，根據(jù)Henry方程，通過測定電泳速度，可計算求出Zeta電位。Henry方程：UE：電泳淌度ζ：Zeta電位ε：介電常數(shù)η：粘度f(κα)：Henry函數(shù)，κ、α是顆粒半徑與雙電層厚度的比值由Henry方程可以看出，只要測得粒子的淌度，查到介質(zhì)的粘度、介電常數(shù)等參數(shù)，就可以求得Zeta電位。3.光譜分析原理光的本質(zhì)是一種電磁輻射，一種以極大的速度通過空間，而不是要以任何物質(zhì)作為傳播媒介的能量形式，具有與電磁輻射共同的性質(zhì)，即波動性和粒子性。凡是基于檢測能量作用于待測物質(zhì)后產(chǎn)生的輻射信號或所引起的變化分析方法均可稱為光學光譜分析法，簡稱光學分析法。圖四.光譜分析原理圖不同的光譜分析儀器結(jié)構(gòu)差異很大，但不管如何復雜，光譜分析儀器一般包括五個基本單元：光源、單色器、樣品容器、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。①近紅外紫外可見分光光度計工作原理：利用一定頻率的紫外可見光照射被分析的有機物質(zhì)，引起分子中價電子的躍遷，它將有選擇的被吸收，從而得到一組吸收隨波長而變化的光譜，反映了試樣的特征。圖五、光譜儀器的通用構(gòu)成②紅外分析光譜儀工作原理：紅外光譜法是鑒別化合物和進行物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)研究的重要手段之一，同時也是物質(zhì)組分定量分析的方法之一。它是一種借助紅外光被物質(zhì)吸收情況，獲得被測物質(zhì)分子內(nèi)部原子間相對震動和分子轉(zhuǎn)動等信息，進而對物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)進行分析研究的方法。紅外光譜的波長范圍在0.75~1000m之間，在實際工作中，習慣用波數(shù)表示吸收譜帶位置，橫坐標為波數(shù)(?=104/)單位cm-1，縱坐標為透射百分比T%圖六、紅外分析光譜儀③熒光分光光度計工作原理：處于基態(tài)的分子吸收能量（以電、熱、化學和光能等形式）被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，然后從不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)回到基態(tài)并放出光子，由于分子結(jié)構(gòu)的不同，其激發(fā)態(tài)能級的分布具有各自不同的特征，從而得到不同的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜，進而對物質(zhì)進行定量和定性。·有機分子中的能級躍遷：圖七、有機分子中的能級躍遷三、實驗內(nèi)容1.接觸角測試儀操作方法打開電腦、儀器，除去鏡頭罩，打開光源及程序；將固體樣品平整固定，安放在載物臺上。清洗加樣器，加測試液體，將加樣器固定于儀器支架上，通過左右及上下微調(diào)旋鈕，將針頭位置調(diào)整至鏡頭視野上部；調(diào)焦，使針頭影像達到最清晰的狀態(tài)。加樣測試：將一滴液體滴在固體樣品上；調(diào)整基線（紅色線），使基線與固液界面重合；調(diào)整計算面積（藍色線），使藍色線框剛好將液滴圈住。點擊AutoCalculate，Numberofframes選擇3（測量三次）。設置好測試參數(shù)后，點擊“Rec”，記錄圖像，點擊“Next”，；新的窗口中點擊Copytochipboard，將數(shù)據(jù)粘貼到Excel表格上。2.激光粒度儀的操作方法打開儀器后面的開關(guān)及顯示器，待機器預熱，穩(wěn)定30分鐘左右后使用。打開“ParticleSizing”程序，“File–Database”選擇所要保存數(shù)據(jù)的文件夾。將待測溶液加入樣品杯中，插入樣品槽，關(guān)上蓋子，待儀器自動調(diào)整完成。點擊程序主界面“Parameters”，對測量參數(shù)進行設置（如圖八）：圖八、測量參數(shù)設置圖參數(shù)設置好后，點擊“OK”，回到主界面點擊“Start”開始測量。儲存數(shù)據(jù)：用*.txt格式輸出數(shù)據(jù)：“File”–“SaveAs”–“TextFileReport”或者直接將界面中的畫面粘貼到Word。Zeta電位儀操作流程：打開儀器后面的開關(guān)及顯示器，待機器預熱，穩(wěn)定30分鐘左右后使用。打開“PALSZetaPotentialPlus”，“File–Database”選擇所要保存數(shù)據(jù)的文件夾。將待測溶液加入樣品杯（約1.5mL）中，鈀電極插入溶液中，連上插頭，關(guān)上蓋子，等到儀器自動調(diào)整完成，就可以開始進行測量了。點擊程序主界面“Parameters”，對測量參數(shù)進行設置（如下圖）：參數(shù)設置好后，點擊“OK”，主界面點擊“Start”開始測量。儲存數(shù)據(jù)：用*.txt格式輸出數(shù)據(jù)：“File”–“SaveAs”–“TextFileReport”或者直接將界面中的畫面粘貼到Word。3.光譜分析各儀器操作方法①紅外紫外可見分光光度計操作方法：·GARY4000紫外分光光度計預熱20min后打開電腦。雙擊“Cary-WinUV”圖標。在“Win-UV”主窗口下，選擇所用的軟件（讀數(shù)、濃度測定、波長掃，動力學，掃描動力學等），雙擊所需圖軟件，進入實驗。以波長掃描為例：進入測試軟件主頁面后，單擊Setup，按照自己的實驗要求，進行實驗軟件參數(shù)的設置，完成后按OK，把空白樣品放入樣品槽內(nèi)，單擊主菜單上的Baseline，進行基線校正。如需調(diào)零，單擊Zero，進行零基線校正。把待測樣品放入樣品槽后，點擊“Start”開始相應的實驗如在參數(shù)設置時，實驗前設置自動保存時，此時出現(xiàn)一個對話框，填寫待測樣品名稱和保存路徑，開始試驗。如沒設置實驗前自動保存，請實驗后保存實驗結(jié)果。實驗完成后，整理好實驗臺。填寫儀器使用記錄表?！と樟-3900打開紫外分光光度計主機打開電腦，打開UVSolution軟件，待機器自檢初始化完成再開始操作。根據(jù)自己的需求選擇試驗方式。，點擊Method按鈕，按照自己的實驗要求，進行實驗軟件參數(shù)的設置，完成后按確定。點擊Sample按鈕，設置樣品名稱，以及輸出文件夾。在樣品室中放入空白樣品，點擊Basline進行基線掃描。放入測試樣品，點擊Measure進行掃描。實驗結(jié)束保存數(shù)據(jù)。關(guān)閉電腦和紫外分光光度計主機。②紅外分析光譜儀操作方法：打開電腦。將500ml液氮倒入冷卻箱內(nèi)，灌液氮時要少量多次緩慢地灌入，維持20min后再補加一定量的液氮,充分冷卻檢測器。將所用附件放入樣品室。打開儀器電源開關(guān)。選擇軟件中collect下拉菜單—rapidscan按鈕—設置相應參數(shù)進行背景掃描。（第一次取背景時速度慢，不要進行其它操作，容易死機，請耐心等待）放入樣品進行測試。測試結(jié)束后，將儀器和電腦關(guān)閉。8)寫好詳細的實驗記錄。③熒光分光光度計操作方法：CaryEclipse操作流程：1）打開電腦。2）打開CaryEclipse主機（樣品室內(nèi)應為空）。3）由桌面進入CaryEclipse文件夾，選擇相關(guān)應用程序（Advancereads，Scan，Concentration，SimpleReads，Kinetics）。4)下面以Scan為例，說明相關(guān)操作順序：雙擊Scan圖標，進入程序。·設置數(shù)據(jù)采集參數(shù)，單擊Setup，在對話框中設置實驗參數(shù)?！ぴO置掃描選項：在Options對話框中設置相關(guān)參數(shù)?！みx擇相關(guān)附件。·在運行之前，對數(shù)據(jù)存儲進行設置（樣品名稱和數(shù)據(jù)存放位置）?！ら_始掃描：將待測樣品放入樣品室，單擊Start彈出SampleName對話框，輸入相應名稱后點擊OK開始掃描。5)數(shù)據(jù)存儲：在File菜單中選擇Saveas將數(shù)據(jù)存儲。6)完成所有操作，取出樣品，清理實驗臺，關(guān)閉CaryEclipse主機和相關(guān)附件，關(guān)閉電腦和電源?！ORIBAFM-4P操作流程：1)打開電腦2)打開熒光分光光度計主機。3)由桌面進入FluorEssence軟件，點擊選擇相應實驗程序（spectra，Kinetics，3D，singlepoint）4)校準波長：點擊左側(cè)detector按鈕，選擇R1參比檢測器，單擊右下角Run進行空掃，如果最大波長在467nm，則無需校準，如果有差距，則需對儀器進行校準。選擇是點擊右下角RTC(實時控制)，點擊Monos選項，激發(fā)波長設置為467nm，點擊右側(cè)矯正按鈕，開始校正。5)以spectra為例，說明相關(guān)操作順序，單擊spectra圖標，進入程序?！みx擇所需掃描類型：（激發(fā)光譜、發(fā)生光譜、同步掃描）。·設置掃描選項，在Monos中設置相關(guān)參數(shù)。·將樣品放入樣品室，關(guān)閉樣品倉門。·單機右下角Run開始掃描。·儲存實驗數(shù)據(jù)?！ね瓿伤胁僮?，取出樣品，清理實驗臺，關(guān)閉主機，關(guān)閉電腦和電源。·做好實驗記錄。四、注意事項1.接觸角測試儀注意事項液滴盡量靠近試樣的前端邊緣；液滴盡可能位于視窗的中心；液滴邊緣要清晰、規(guī)則；避免可能使加樣器針尖產(chǎn)生磨損的一切行為，使用后要用超純水清洗，晾干，妥善保管；禁止用手觸摸攝像頭鏡頭等光學部件；禁止使用加樣器測量不易清洗的溶液如堿類、磷酸鹽類、清潔劑類、鹵代烴類溶液等；儀器變壓器應使用9V電源；實驗完成后，關(guān)閉儀器，清洗、規(guī)整物品，做好使用記錄；2.動態(tài)光散射的注意事項樣品測量范圍2nm～3μm，濃度體積比≤0.5%，體積0.5～3mL。測量時間1～2min/Run（對于一個未知體系樣品，至少＞2min/Run）。樣品放入樣品池后需要在儀器中穩(wěn)定20min左右，以保證溫度平衡。具體時間可以隨環(huán)境不同進行調(diào)整。對于一個未知體系，無法確定其最佳測試濃度時，可以將該測試溶液的濃度減半，如果光強（kcps）也跟著降低一半左右，則這兩種濃度都是可以進行測量的?？梢杂糜谒芰蠘悠烦販y量的溶液：水、甲醇、乙醇、己烷和環(huán)己烷，不能檢測的：苯酚、甲苯、丙酮、丁酮和四氯化碳。保存好數(shù)據(jù)，實驗完畢須將樣品池內(nèi)部、周圍擦拭干凈。實驗結(jié)束后做好實驗記錄。Zeta電位量程-150～+150mV，樣品體積1～1.5mL，溫度范圍6～100°C±0.1°C，pH范圍2～12±0.01，電極材料為鈀電極，激光源為35mW固體激光器;鈀電極用后應及時清洗干凈，應以去離子水進行清洗。清洗的不徹底，會造成電極發(fā)黑，故此在用去離子水進行清洗后，應以濕潤濾紙進行擦拭，最后用清潔干燥的濾紙將電極上殘余的液體吸干；出于保護電極周圍的材料的目的，測量Zeta電位時嚴禁使用有機溶劑；一般來講，測定的Zeta電位的絕對值＞25mV的時候才能說明該體系顆粒具有良好的分散性（也有學者認為是＞30mV）；保存好數(shù)據(jù)，實驗完畢后須將樣品池內(nèi)部及四周清理干凈；實驗結(jié)束后做好實驗記錄；3.光譜分析各儀器注意事項①紅外紫外可見分光光度計注意事項1)儀器使用前提前一天到儀器負責人處預約，測試前應開機預熱20min以上；2)測試完成后務必將樣品池取出，不可遺落在儀器內(nèi)；3)拿取比色皿時，應用手指接觸比色皿的磨砂界面，以避免對光學表面的觸碰；4)盛裝溶液時，高度為1.5cm即可，光學表面如有殘液可先用清潔濾紙輕輕吸附，再以鏡頭紙或絲綢擦拭；5）比色皿使用后，應立即用所用溶液進行沖洗。必要時可用1:1的鹽酸浸泡，然后用水沖洗干凈。禁止將比色皿放在火焰中、電爐上或干燥箱內(nèi)操作；6)石英吸收池通?？捎美渌峄蚓凭?、乙醚等有機溶劑清洗。粘合的玻璃比色皿不能用酸或堿清洗，更要避免用熱濃酸清洗，通常用蒸餾水漂洗，然后用少量溶液淌洗；7)更換固體支架與液體支架時要輕拿輕放，減少震動以免使儀器受到損傷；8)使用后要及時對附件清洗、還原，保持樣品倉清潔、干燥；9)儀器使用前后應及時登記，出現(xiàn)異常時要及時報告老師及相關(guān)人員。②紅外分析光譜儀注意事項：使用儀器前要提前和負責人打招呼，對于操作不熟練的人員，可請負責人在一旁指導操作。使用完儀器后必須將樣品取出，并對所用附件進行清潔整理。使用完畢請認真填寫實驗記錄，包括測試條件和所用附件。水與CO2對實驗結(jié)果有著強烈的干擾，水對儀器有著強烈的破壞作用，所以，在實驗過程中一定要避免與水的接觸。操作時不要說話；含有水分的樣品做完應盡快從樣品池中取出，以免使KBr窗片潮解；實驗時要使用無水乙醇浸泡的酒精棉擦拭樣品臺及附件。不要用眼睛直接對著激光光源，以免造成損傷。禁止對軟件進行不當?shù)牟僮?，這樣極易造成軟件與操作系統(tǒng)的沖突，導致儀器不能正常使用。測試前認真檢查儀器參數(shù)設置，不要隨意修改儀器參數(shù)，影響他人實驗。當光路區(qū)中變色硅膠由藍變紅，要把它取出進行干燥，在取出期間，機器停止使用。液氮容易造成凍傷，添加的時候需帶好防護手套，小心謹慎添加。取用KBr時，不能將KBr污染，避免影響其他同學做實驗。對于液體樣品，使用前要對所用溶劑的性質(zhì)詳細了解，避免將樣品臺及附件腐蝕。氮氣吹掃與否以及吹掃時間可視需要進行。長時間使用時，應注意補充液氮。導出數(shù)據(jù)禁止使用U盤。③熒光分光光度計注意事項：1)石英池用后及時清洗，禁止使用超聲或酸洗。2)溢出樣品室的樣品必須立刻擦拭干凈。3)保持儀器的表面清潔，請勿放置物品于儀器上。4)儀器清潔過程中請勿擦拭石英窗。5)溫控操作：設置溫度控制之前打開水泵并務必將其放入清潔的蒸餾水中。6)注意除塵，實驗過程中水泵保持在液面以下。實驗結(jié)束后請將蒸餾水倒掉。7)導出數(shù)據(jù)必須使用光盤刻錄。8)檢測結(jié)束后，取出樣品，整理附件，清潔操作環(huán)境。關(guān)閉儀器與附件電源后關(guān)閉電腦主機和主電源。9)使用完畢請認真填寫實驗記錄，包括測試條件、附件以及儀器運行狀態(tài)。10)機器一旦出現(xiàn)任何異常現(xiàn)象，即時與相關(guān)負責人聯(lián)系。實驗五、二維電泳系統(tǒng)、快速高效蛋白純化工作站及實時熒光定量PCR儀的使用實驗時間：2014年12月24日實驗地點：科學園2E棟113室指導老師：曲有鵬一、實驗目的1.掌握各類儀器分析的基本原理和方法2.熟悉各種專用儀器的基本結(jié)構(gòu)、用途、定性定量分析的依據(jù)和方法3.掌握各種儀器相關(guān)實驗技術(shù)二、實驗原理1.二維電泳系統(tǒng)工作原理雙向凝膠電泳的原理是第一向基于蛋白質(zhì)的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS分離，把復雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。通常第一維電泳是等電聚焦，變性的蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點的不同進行分離。在第二維電泳過程中，結(jié)合SDS的蛋白質(zhì)從等電聚焦凝膠中進入SDS－聚丙烯酰胺凝膠，在濃縮膠中被濃縮，在分離膠中依據(jù)其分子量大小被分離。這樣各個蛋白質(zhì)根據(jù)等電點和分子量的不同而被分離、分布在二維圖譜上。由于二維電泳具有很高的分辨率，它可以直接從細胞提取液中檢測某個蛋白。2.快速高效蛋白純化工作站工作原理蛋白純化是利用不同蛋白間內(nèi)在的相似性與差異進行分離純化，利用各種蛋白間的相似性來除去非蛋白物質(zhì)的污染，而利用各蛋白質(zhì)的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學活性都會有差異，利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來得到重組蛋白。圖一、AKTApurifier10工作簡圖蛋白的純化大致分為粗分離階段和精細純化階段二個階段。一般蛋白純化采用的方法為樹脂法。粗分離階段主要將目的蛋白和其他細胞成分如DNA、RNA等分開，由于此時樣本體積大、成分雜，要求所用的樹脂高容量、高流速、顆粒大、粒徑分布寬．并可以迅速將蛋白與污染物分開，必要時可加入相應的保護劑（例如蛋白酶抑制劑），防止目的蛋白被降解。精細純化階段則需要更高的分辨率，此階段是要把目的蛋白與那些分子量大小及理化性質(zhì)接近的蛋白區(qū)分開來，要用更小的樹脂顆粒以提高分辨率，常用離子交換柱和疏水柱，應用時要綜合考慮樹脂的選擇性和柱效兩個因素。選擇性指樹脂與目的蛋白結(jié)合的特異性，柱效則是指各蛋白成分逐個從樹脂上集中洗脫的能力，洗脫峰越窄，柱效越好。僅有好的選擇性，洗脫峰太寬，蛋白照樣不能有效分離。3.實時熒光定量PCR工作原理實時熒光定量PCR技術(shù)（Real-timequantitativePolymeraseChainReaction簡稱RealTimePCR）是在定性PCR技術(shù)基礎上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Appliedbiosystems公司推出，在PCR反應體系中加入熒光基團，隨著PCR反應的進行，PCR反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。

利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，使每一個循環(huán)變得“可見”，最后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(或cDNA)的起始濃度進行定量的方法。實時熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數(shù)最敏感、最準確的方法。如果用于RNA檢測，被稱為逆轉(zhuǎn)錄實時PCR即（Real-timeRT-PCR）是實時PCR法，它是指對DNA或經(jīng)過反轉(zhuǎn)入（RT-PCR）的RNA通過聚合酶鏈式反應并實時監(jiān)測DNA的放大過程，在擴增的指數(shù)增長期就測量擴增產(chǎn)物，因為擴增指數(shù)增長期測量值與特異DNA（RNA）起始量存在相關(guān)性，從而實現(xiàn)定量檢測。RealTimePCR的基本目標是精確測量和鑒別非常微量的特異性核酸，從而可通過監(jiān)測CT值而實現(xiàn)對原始目標基因的含量定量。實時熒光定量PCR法最大的優(yōu)點是克服了終點PCR法進入平臺期或叫飽和期后定量的較大誤差，實現(xiàn)DNA/RNA的精確定量。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實現(xiàn)多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點，該技術(shù)在醫(yī)學臨床檢驗及臨床醫(yī)學研究方面有著重要的意義。三、實驗內(nèi)容1.二維電泳系統(tǒng)操作方法1）吸取適量含有樣品的水化液放入標準型膠條槽中，不要加入過量的水化液。2）從酸性端（尖端）一側(cè)剝?nèi)PG膠條的保護膜，膠面朝下，先將IPG膠條尖端(陽性端)朝標準型膠條槽的尖端方向放入膠條槽中，最后放下IPG膠條平端(陰極)，使水化液浸濕整個膠條，并確保膠條的兩端與槽的兩端的電極接觸。3）IPG膠條上覆蓋適量ImmobilineDryStrip覆蓋油，蓋上蓋子4）將標準型膠條槽的尖端背面電極與IPGphor儀器的陽極平臺接觸,膠條槽的平端背面電極與IPGphor儀器的陰極平臺接觸。5）設置IPGphor儀器運行參數(shù)：IPG膠條水化的電壓，溫度和時間；等電聚焦電泳時的梯度電壓和溫度6）IPG膠條水化后可自動進行等電聚焦電泳。7）IPG膠條平衡兩次，每次15分鐘,有利于蛋白從第一向到第二向的轉(zhuǎn)移。第一步平衡在平衡液中加入DTT，使變性的非烷基化的蛋白處于還原狀態(tài)；第二步平衡步驟中加入碘乙酰胺，使蛋白質(zhì)巰烷基化.8）將IPG膠條輕輕潤洗，并去除多余的平衡緩沖液，然后放入第二向SDS膠中。9）垂直SDS,電泳槽中裝滿電泳緩沖液，并打開溫控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)溫度為15°C。10）將平衡好的IPG膠條浸入電極緩沖液中幾秒鐘。11）將IPG膠條小心的放置于SDS膠面上，并輕壓使IPG膠條與SDS膠面充分結(jié)合，上面覆蓋2ml熱的瓊脂糖溶液(75°C)，使瓊脂糖在5分鐘內(nèi)凝固。其余的IPG膠條重復上述操作。12）將膠盒插入電泳槽中，開始電泳。采用垂直的SDS膠電泳，不必象水平電泳一樣，電泳過程中去除IPG膠條。13）當溴酚藍染料遷移到膠的底部邊緣即可結(jié)束電泳。14）跑好的膠轉(zhuǎn)移到染色盒里固定，準備染色。2.快速高效蛋白純化工作站操作方法①打開主機和電腦電源，待儀器自檢完畢，雙擊桌面上UNICORN圖標，進入操作界面。②準備流動相和樣品③清洗管道及裝柱首先將A1管道放入平衡液或bandingbuffering中，將B1管道放入高鹽溶液中或elutionbuffering中，在systemcontrol窗口點擊manual→pump→pumpwashbasic，選中A1,B1管道為ON，execute。泵清洗程序會自動運行結(jié)束。選擇manual→pump→flowrate，輸入流速1mL/min，insert；選擇manual→Alarm&mon→alarmpressure，設置highalarm，insert，execute。將進樣閥的1號位管道接入柱子的柱頭，稍微擰緊后將柱下端的堵頭卸掉，直接擰入紫外流動池或連接管道。④手動運行1）平衡：柱子平衡好了。此時將紫外調(diào)零，選擇manual→Alarm&mon→autozero，exectue，就準備上樣了。2）上樣：用樣品環(huán)上，將樣品吸進注射器，推掉氣泡，從進樣閥的3號位推入，不要取下注射器。選擇manual→flowpath→injectionValve→inject，execute。2.1）用樣品泵上樣，將樣品置于SampleValve1號位，點擊manual→pump→DirectLoad_960輸入進樣流速和體積，execute。注意樣品的管路要事先充滿緩沖液。2.2）用系統(tǒng)泵上樣：點擊pause，將A1放入樣品中，點擊countine；待樣品上完后，再將A1放入到平衡液中繼續(xù)清洗柱子。3）洗脫：用緩沖液盡量將穿透峰洗回基線。選擇manual→pump→gradient，按照自己的條件選擇target百分比和length，execute。4）收集：4.1）固定體積收集：選擇manual→Frac→fractionation_900,輸入每管收集體積，exectue。結(jié)束固定體積收集選擇Frac→fractionation_stop_900，exectue。4.2）峰收集：選擇manual→Frac→Peak_FracParametersUV，輸入峰收集參數(shù)，insert，點擊Peak_Fractionation_900，輸入每管最大收集體積，insert，exectue。結(jié)束峰收集，選擇Peak_FracStop_900,execute。⑤編程及自動運行1）點擊mothededitor窗口里工具欄的mothedwizard快捷圖標，打開對話框。2）按照對話框的要求選擇條件，編好后按finish出現(xiàn)編程結(jié)果，在變量框中可以更改變量。保存點擊工具欄里的保存快捷圖標，輸入文件名，點擊ok。3）運行自動程序：在systemcontrol窗口點擊工具欄中的RUN打開編好的方法，點擊next直到start開始運行。4）運行中，按下工具欄上的hold鍵表示保持目前的運行模塊狀態(tài)不進入到下一個命令中。點擊manual→other→nextbreakpoint表示進入到下一個模塊指令。5）運行結(jié)束后，結(jié)果自動保存。關(guān)機流程：清洗系統(tǒng)及拆柱:將A1和B1入口放入純水中，啟動pumpwashpurifier功能沖洗A泵和B泵及整個管路。然后再將A1和B1入口放入20％乙醇中，同樣操作將乙醇沖滿整個管路保存。系統(tǒng)給柱子一個慢流速，設置系統(tǒng)保護壓力，然后先拆柱子的下端，擰上堵頭，再拆柱子的上端，擰上堵頭。從軟件控制系統(tǒng)的第一個窗口unicornmanager點擊退出，其他窗口不能單獨關(guān)閉。然后關(guān)閉AKTA主機電源，關(guān)閉電腦電源。3.實時熒光定量PCR操作方法①ABI7500實時熒光定量PCR儀：開機流程：接通電腦及7500主機電源。打開電腦，待所有程序啟動完成。按下7500主機右下角電源開關(guān)，待主機自檢完成，綠燈常量后方可進行下一步。雙擊電腦桌面7500systemsoftware軟件圖標，彈出窗口中點擊Createnewdocument選項，選取默認值點擊Next。在窗口中選擇探針或染料類型，點擊Add添加后點擊Next，編輯樣品盤后點擊Finish。在7500systemSDSsoftware窗口中進