大孔樹脂富集純化蜘蛛香總黃酮工藝研究

蜘蛛科屬植物，也被稱為“馬蹄香”、“虎七”和“印度香”。主要分布在我國湖北省恩施、貴州、湖南等西南部少數(shù)民族地區(qū)。根治性腹瀉、嘔吐、兒童期腹瀉、風、冷和濕等。研究表明,蜘蛛香黃酮類化合物主要有橙皮苷、芹菜素、蒙花苷、蒙花苷異戊酸酯以及山柰酚等,具有抗炎抑菌、抗腫瘤作用。現(xiàn)有文獻研究發(fā)現(xiàn)蜘蛛香水提取物具有顯著的鎮(zhèn)痛作用,本課題組對于蜘蛛香總黃酮和總纈草三酯提取物進行了藥理實驗,結(jié)果亦顯示其黃酮提取物是其發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的有效部位。因此本實驗采用大孔吸附樹脂對蜘蛛香中黃酮類成分進行富集,為鎮(zhèn)痛有效部位篩選提供參考,對于進一步開發(fā)利用蜘蛛香鎮(zhèn)痛活性成分提供基礎(chǔ)。1儀器、設(shè)備和生物固結(jié)KQ3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),UV1100紫外分光光度計(上海天美科學(xué)儀器有限公司),UPT—I—10T型優(yōu)譜UPT系列超純水器(成都超純科技有限公司),BS124S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司),R—201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、恒溫水浴鍋W201B(上海申勝生物技術(shù)有限公司),SHB—III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科技工貿(mào)有限公司)。D-101、AB-8、HPD-600、D-301型大孔吸附樹脂及95%乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉等均購自成都亞榮生化設(shè)備有限公司。蜘蛛香藥材采自湖北恩施州利川市福寶山,經(jīng)湖北民族學(xué)院中藥鑒定教研室朱敏英教授鑒定為敗醬科植物蜘蛛香ValerianajatamansiJones的干燥根莖和根。橙皮苷(質(zhì)量分數(shù)>98%,批號110721-200512)由中國食品藥品檢定研究院提供。2方法和結(jié)果2.1干燥、干燥、干燥將蜘蛛香藥材粉碎并過40~180目篩,以1∶10比例的石油醚回流脫脂2次,抽濾,洗滌,再放入40℃條件下的鼓風干燥箱中干燥1h,備用。2.2采用蜘蛛香黃酮紫外分光光度法測定黃酮總黃酮2.2.1吸光度測定稱取橙皮苷對照品5.53mg,置50mL量瓶中,甲醇溶解并加至刻度,即得0.1106mg/mL溶液。分別移取上述溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL置于10mL量瓶中,加甲醇至刻度。以甲醇作空白,于284nm波長處測定吸光度值。以吸光度值對質(zhì)量濃度作圖,繪制標準工作曲線,得回歸方程Y=0.035X-0.006,r=0.9993,線性范圍5.53~27.65μg/mL。2.2.2黃酮總黃酮的測定2.3含生藥0.1g/ml提取液的制備稱取蜘蛛香粉末100g,加入適量60%乙醇,浸泡6h后超聲提取3次,每次30min,濾過,濾液減壓濃縮至無醇味,3500r/min離心,取上清液,即得含生藥0.1g/mL提取液。2.4大孔樹脂對總黃酮的動態(tài)吸附和解吸實驗準確量取預(yù)處理好的D-101、AB-8、HPD-600、D-301大孔吸附樹脂各20g,裝入樹脂柱中,分別吸取0.1g/mL蜘蛛香提取液20mL,通過樹脂柱,進行動態(tài)吸附。4種大孔樹脂對總黃酮的動態(tài)吸附和解吸見表1。綜合考察吸附和解吸性能得出HPD-600大孔樹脂對蜘蛛香總黃酮的吸附和解吸能力合宜,是較為合適的純化樹脂。2.5hpd-600各儒家框架吸附因素的確定2.5.1總黃酮的泄漏曲線稱取HPD-600干樹脂5g,裝柱,加入蜘蛛香提取液100mL(含總黃酮6.06mg/mL)進行交換吸附,調(diào)節(jié)體積流量為1mL/min收集流出液,5mL收集1次,共收集15份,編號,制成總黃酮制備液,測定吸光度值。當流出液體積為10~20mL時,總黃酮泄露曲線上升緩慢,此階段為樹脂吸附階段。當流出液為25mL時,泄露曲線變化陡峭,說明已有大量藥液泄露。當流出液為40mL時,樹脂已達到飽和吸附,流出液中總黃酮質(zhì)量濃度與之后比較沒有明顯變化,故選擇最大上樣量為20mL,此時藥液泄露較少且樹脂吸附充分,此時樹脂的動態(tài)吸附容量為24.24mg/g。見圖1。2.5.2總黃酮的吸附稱取3份吸干其表面水分的HPD-600樹脂各5g,置于100mL三角瓶中。分別量取蜘蛛香提取液3份各10mL,用稀鹽酸和0.1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH5、9、7,分別加入3份樹脂中,置于20℃恒溫水浴箱中,間隔30min振蕩1min,60次/min,2h后抽濾,得濾液,制成總黃酮制備液,測定吸光度,計算總黃酮的質(zhì)量濃度,得吸附量和吸附率,見表2。結(jié)果顯示,上樣液呈中性時HPD-600樹脂對其中黃酮類成分的靜態(tài)吸附效果較好。2.5.3不同體積流量對hpd-400樹脂吸附蛛香總黃酮的影響稱取4份吸干其表面水分的HPD-600樹脂各5g,分別加入20mL蜘蛛香提取液,考察體積流量1、3、5、7mL/min對HPD-600樹脂吸附蜘蛛香總黃酮的影響。分別收集流出液,測定吸光度,計算吸附量和吸附率。結(jié)果見表3。結(jié)果顯示,體積流量越慢,流出液中的總黃酮質(zhì)量濃度越少,即被HPD-600樹脂交換吸附的總黃酮越多。2.5.4樹脂吸附總黃酮的量稱取5份吸干其表面水分的HPD-600樹脂各10g濕法裝柱,將總黃酮質(zhì)量濃度分別為12.12、6.06、3.03、1.52、0.76mg/mL提取液各50mL,分別以1mL/min通過樹脂柱,室溫動態(tài)吸附。檢測流出液中蜘蛛香總黃酮質(zhì)量濃度,計算吸附量,見表4。結(jié)果顯示,在一定濃度范圍內(nèi),隨著上樣液質(zhì)量濃度增加,樹脂對蜘蛛香總黃酮的吸附容量先增加后減少,在總黃酮低濃度區(qū)間,隨著上樣量質(zhì)量濃度的提高,單位量樹脂可吸附的總黃酮量增加,因而樹脂吸附容量提高。但由于體積流量恒定,隨總黃酮質(zhì)量濃度的進一步提高,蜘蛛香總黃酮分子在樹脂內(nèi)部擴散能力可能降低,且質(zhì)量濃度增加后,與總黃酮競爭樹脂吸附位點的雜質(zhì)量也會增加,因而樹脂的目標吸附量反而下降,因此選擇上樣液總黃酮質(zhì)量濃度為3.03mg/mL為宜。2.6hpd-600各層樹脂的分解因素確定2.6.1%乙醇溶液洗脫脫脫率測定稱取3份已吸附蜘蛛香總黃酮的HPD-600樹脂(取適量HPD-600樹脂用一定量蜘蛛香提取液浸泡過夜后抽濾)各5g,分別用80%乙醇、0.1mol/LNaOH的80%乙醇溶液、0.1mol/LHCl的80%乙醇溶液60mL洗脫,洗脫3次,每次20mL。加入洗脫液后各振蕩1min,60次/min,靜置30min后濾過,分別合并濾液,濃縮定容至50mL,吸取0.2mL定容至10mL,測定吸光度,計算洗脫液中總黃酮質(zhì)量濃度,比較洗脫率,見表5。結(jié)果顯示洗脫率大小為0.1mol/LNaOH的80%乙醇>0.1mol/LHCl的80%乙醇>80%乙醇。選擇0.1mol/LHCl的80%乙醇作為洗脫劑效果較好。2.6.2洗脫溶劑總黃酮的測定各取20g已吸附蜘蛛香總黃酮的HPD600樹脂4份,裝柱,分別用80%乙醇的0.05、0.10、0.20、0.4mol/LHCl溶劑100mL作為洗脫劑洗脫。分別收集洗脫液,測定洗脫液中總黃酮質(zhì)量濃度,見表6。結(jié)果顯示,HCl溶液濃度為0.1mol/L時,洗脫下來的總黃酮質(zhì)量濃度較高,故選擇0.10mol/LHCl。2.6.3洗脫溶劑的制備取20g已處理備用的HPD-600樹脂裝柱,精密吸取3.03mg/mL蜘蛛香提取液20mL濕法上樣,分別用0.1mol/LHCl的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液為洗脫劑,用量均為100mL,按1.0mL/min進行洗脫。分別收集洗脫液,制成總黃酮制備液,測定其中總黃酮的質(zhì)量濃度,結(jié)果見表7。結(jié)果顯示,洗脫溶媒確定為先用0.1mol/LHCl的10%乙醇溶液洗脫除雜,后用0.1mol/LHCl的80%乙醇溶液洗脫。2.6.4洗脫除雜的總黃酮溶液的制備取已處理備用的HPD-600樹脂10g裝柱,分別加入含蜘蛛香總黃酮質(zhì)量濃度為3.03mg/mL提取液20mL,待吸附后,用0.1mol/LHCl的10%乙醇溶液洗脫除雜,直至洗脫液顏色變淺、固形物不再增加,再用0.1mol/LHCl的80%乙醇溶液洗脫沖洗至流出液接近無色,收集洗脫液,20mL作為1個流份,共收集10份。揮干,制成總黃酮溶液,測定吸光度,見圖2。結(jié)果顯示,當收集到第5份時,洗脫液中總黃酮質(zhì)量已降至1.56mg,故認為此洗脫溶媒系統(tǒng)100mL(5BV)即可將總黃酮洗脫完全。2.7黃酮與乙醇溶液的收率稱取HPD-600樹脂100g濕法裝柱,分別加入總黃酮質(zhì)量濃度為3.03mg/mL的中性提取液500mL進行動態(tài)交換吸附,至吸附均勻后,先用0.1mol/LHCl的10%乙醇溶液洗脫除雜,直至洗液顏色不再變淺、固形物不再增加,后用0.1mol/LHCl的80%乙醇溶液,以1mL/min洗脫5倍柱體積,最后收集洗脫液,平行操作5份,計算收率和總黃酮質(zhì)量分數(shù),結(jié)果其平均收率為39.01%,質(zhì)量分數(shù)達到55.25%,RSD分別為3.12%,2.58%。相對蜘蛛香藥材中總黃酮質(zhì)量分數(shù)提高近35倍,表明此工藝條件穩(wěn)定可行。3總黃酮的純化本研究分別比較了橙皮苷和供試品最大吸收波長,二者相差在3nm以內(nèi),因此選擇284nm作為測定波長;做上樣體積流量考察時,隨著體積流量的升高,其吸附率降低,可能是由于黃酮苷分子擴散速率較慢,體積流量升高,使大量黃酮苷來不及與HPD-600樹脂交換吸附而發(fā)生泄漏。在靜態(tài)解吸附考察時,堿性乙醇溶液的解吸附率最高,其次是酸性乙醇洗脫液,最后是乙醇液。通過顏色觀察及波長掃描發(fā)現(xiàn)0.1mol/LNaOH的80%乙醇溶液洗脫液最大吸收波長為207nm,偏離目標波長284nm較大,其黃酮類成分可能在堿液中已被破壞。樹脂裝柱上樣后,用水沖洗僅洗脫掉糖類、水溶性雜質(zhì),無法去除一些脂溶性色素,而用低體積分數(shù)乙醇沖洗可去除這類雜質(zhì),但是除雜的同時也會損失部分黃酮成分,考慮既要盡量除雜又要最大限度地富集有效成分,因此在洗脫前用10%乙醇沖洗樹脂柱至接近無色。本實驗分別比較了4種不同極性大孔樹脂的吸附率和解吸率,最后選擇HPD-600樹脂,考察了HPD-600樹脂上樣量、pH值、洗脫體積流量、質(zhì)量濃度、洗脫劑的種類等因素對蜘蛛香總黃酮類成分的影響,從而得到純化工藝參數(shù),HPD600樹脂對蜘蛛香總黃酮具有較大的吸附量,易吸附、易解吸,試驗中確定的總黃酮純化工藝可使其總黃酮