第二章發(fā)酵液的預(yù)處理

第一節(jié)概述第二節(jié)發(fā)酵液預(yù)處理的方法第三節(jié)發(fā)酵液的固液分離及設(shè)備基本要求：了解發(fā)酵液的特性和固液分離及設(shè)備，掌握發(fā)酵液預(yù)處理的方法。重點(diǎn)：降低液體粘度的方法；凝聚與絮凝；發(fā)酵液中高價(jià)無機(jī)離子的除去；雜蛋白的除去。

一、發(fā)酵液的一般特征

1、發(fā)酵液的組成

（1）大部分是水；

（2）細(xì)胞或碎片；

（3）少量未用完的培養(yǎng)基；

（4）一定量的代謝產(chǎn)物及副產(chǎn)物。

第一節(jié)概述

2、發(fā)酵液的特性

（1）發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，大多為1%~10%；大部分為水，一般為90%~99%。

（2）發(fā)酵液中的懸浮固形物主要是菌體和蛋白的膠狀物，其顆粒小，帶電荷，可形成穩(wěn)定的膠體溶液；相對(duì)密度與液相相差不大；固體粒子可壓縮性大；液相粘度大，大多為非牛頓型流體。

（3）發(fā)酵液中含有培養(yǎng)基成分，對(duì)后續(xù)操作產(chǎn)生一點(diǎn)影響。

（4）發(fā)酵液中有代謝產(chǎn)物及性質(zhì)相似的副產(chǎn)物

（5）發(fā)酵液中還含有色素、毒性物質(zhì)、熱原質(zhì)等有機(jī)雜質(zhì)，導(dǎo)致其性質(zhì)不穩(wěn)定，隨時(shí)間變化。（空氣氧化、微生物污染、蛋白酶水解）二、發(fā)酵液預(yù)處理的目的和要求

1、發(fā)酵液預(yù)處理的目的（1）改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，促進(jìn)從懸浮液中分離固形物的速度，提高固液分離器的效率；（2）盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后續(xù)工序處理的某一相中（多數(shù)是液相）；（3）去除發(fā)酵液中部分雜質(zhì)，以利于后續(xù)各步操作。2、發(fā)酵液預(yù)處理的要求預(yù)處理要滿足以下要求，才能達(dá)到目的。（1）菌體分離采用離心和過濾方法。胞外產(chǎn)物，預(yù)處理時(shí)應(yīng)盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到液相，然后用固液分離除去固相。胞內(nèi)產(chǎn)物，則應(yīng)先收集菌體或細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞破碎后，使產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到液相，再用固液分離除去細(xì)胞碎片。

（2）固體懸浮物的去除采用過濾方法，獲得澄清液（3）蛋白質(zhì)的去除：可溶性蛋白（4）重金屬離子的去除（5）色素、毒性物質(zhì)、熱原質(zhì)等有機(jī)雜質(zhì)的去除（6）改變發(fā)酵液的性質(zhì)，以利于提取和精制后續(xù)工序操作的順利進(jìn)行（7）調(diào)節(jié)適宜的pH和溫度

發(fā)酵液預(yù)處理的方法有三類：提高過濾速度的方法、改變發(fā)酵液性質(zhì)的方法、雜質(zhì)去除的方法。具體方法有凝聚與絮凝方法、加熱法、加水稀釋法、調(diào)節(jié)pH法、加入助濾劑法、加入反應(yīng)劑法、加吸附劑法或加鹽法、高價(jià)無機(jī)離子去除的方法、可溶性雜蛋白去除的方法、色素及其他雜質(zhì)去除的方法等。第二節(jié)發(fā)酵液預(yù)處理的方法一、凝聚與絮凝方法采用凝聚和絮凝技術(shù)能有效改變細(xì)胞、細(xì)胞碎片及溶解大分子物質(zhì)的分散狀態(tài)，破壞其穩(wěn)定性，使其聚結(jié)成較大的可分離的顆粒，以提高過濾速率，便于分離；同時(shí)，還能有效地除去雜蛋白質(zhì)和固體雜質(zhì)，提高濾液質(zhì)量。工業(yè)最常用方法之一。

凝聚和絮凝是兩種方法，兩個(gè)概念。

凝聚是向膠體懸浮液中加入某種電解質(zhì)，在電解質(zhì)的異電離子作用下，由于膠體粒子之間雙電層電排斥作用降低，電位下降，使膠體體系不穩(wěn)定（脫穩(wěn)），膠體粒子間因相互碰撞而聚集成1mm大小塊狀凝聚體的過程。

絮凝是指在某些高分子絮凝劑存在下，基于橋架作用，將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)，形成l0mm大小絮凝團(tuán)的過程。1、凝聚（1）凝聚機(jī)理（原理）凝聚劑的作用有些是對(duì)初始粒子表面電荷的簡(jiǎn)單中和；另一些是消除雙電荷層（采用中性鹽例如NaCl等）而脫穩(wěn)；還有一些是通過氫鍵或其他復(fù)雜的形式與粒子相結(jié)合而產(chǎn)生凝聚。

雙電層的形成及作用發(fā)酵液中的菌體、細(xì)胞或蛋白質(zhì)等膠體粒子的表面，由于吸附溶液中的離子和自身基團(tuán)的電離，一般都帶有電荷。在生理pH值下，菌體或蛋白質(zhì)常常帶有負(fù)電荷，由于靜電引力的作用，使溶液中帶相反電荷的陽離子被吸附在其周圍，在界面上形成雙電層。這種雙電層的結(jié)構(gòu)使膠粒之間不易聚集而保持穩(wěn)定的分散狀態(tài)。雙電層的電位越高，電排斥作用越強(qiáng)，膠體粒子的分散程度也就越大，發(fā)酵液過濾就越困難。凝聚值：使膠體粒子發(fā)生凝聚的最低電解質(zhì)濃度（mmol/L），表示電解質(zhì)的凝聚能力。反離子的價(jià)數(shù)越高，凝聚值就越小，即凝聚能力越強(qiáng)。陽離子對(duì)帶負(fù)電荷的發(fā)酵液膠體粒子凝聚力的次序：Al3+＞Fe3+＞H+＞Ca2+＞Mg2+＞K+＞Na+＞Li+

（2）凝聚劑種類主要是一些無機(jī)類電解質(zhì)，由于大部分被處理物質(zhì)的顆粒帶負(fù)電荷，工業(yè)上常用的凝聚劑大多為陽離子型，分為：無機(jī)鹽類：如硫酸鋁、礬、硫酸鐵和硫酸亞鐵。金屬氧化物類：如氫氧化鋁、氫氧化鐵、氫氧化鈣或石灰等。聚合無機(jī)鹽類：如聚合鋁和聚合鐵等。2、絮凝（1）機(jī)理：絮凝劑主要起架橋作用，即一個(gè)高分子聚合物（絮凝劑）的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上，產(chǎn)生橋架聯(lián)接時(shí)，形成了較大的絮團(tuán)。絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對(duì)分子量可達(dá)數(shù)萬至一千萬，具有長(zhǎng)鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有許多活性官能團(tuán)。通過靜電引力、范德華力或氫鍵的作用，強(qiáng)烈地吸附在膠粒的表面。絮凝劑的結(jié)構(gòu)要求：一方面要求其分子必須含有較多的活性官能團(tuán)，使之能和膠體粒子結(jié)合；另一方面要求有長(zhǎng)鏈的線性結(jié)構(gòu)，以便同時(shí)和多個(gè)膠體粒子結(jié)合。（2）絮凝劑的分類A、按絮凝劑官能團(tuán)分為三大類型：

陰離子性：聚丙烯酸鈉和聚苯乙烯磺酸。

陽離子性：聚丙烯酸二烷基胺乙酯和聚二烯丙基四胺鹽。

非離子性：聚氧化乙烯等。B、根據(jù)來源分:

有機(jī)高分子聚合物：聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物。

無機(jī)高分子聚合物：聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等。

天然高分子有機(jī)物：海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖等。常用的絮凝劑：有機(jī)合成的聚丙烯酰胺類衍生物。優(yōu)點(diǎn)：絮凝速度快，絮凝體粗大，用量小，分離效果好，適用范圍廣。缺點(diǎn)：有一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，不宜用于食品及醫(yī)藥工業(yè)。聚丙烯酸類陰離子絮凝劑，無毒，可用于食品及醫(yī)藥工業(yè)。（3）影響絮凝效果的因素（A）絮凝劑的用量：一般為粒子表面積約有一半被聚合物覆蓋時(shí)所用的絮凝劑量；（B）絮凝劑的相對(duì)分子量和類型；（C）溶液的pH值；（D）攪拌速度和時(shí)間。在絮凝過程中，常需要加入一定的助濾劑以增加絮凝效果。3、混凝無機(jī)電解質(zhì)和絮凝劑交叉使用，可以大大提高絮凝的效果，這種包括凝聚和絮凝機(jī)理的過程，稱為混凝。對(duì)帶負(fù)電荷的菌體或蛋白質(zhì)，陽離子型高分子絮凝劑同時(shí)具有降低膠粒雙電層電位和產(chǎn)生吸附橋架的雙重機(jī)理，所以可以單獨(dú)使用。對(duì)于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，則主要通過分子間引力和氫鍵作用產(chǎn)生吸附橋架，所以它們常與無機(jī)電解質(zhì)凝聚劑搭配使用。在β-半乳糖苷酶（胞內(nèi)酶）發(fā)酵液中采用絮凝技術(shù)除去細(xì)胞碎片的方法，利用脫乙酰殼多糖和聚乙烯亞胺陽離子絮凝劑以及氯化鈣無機(jī)電解質(zhì)，分別在細(xì)胞破碎前后處理發(fā)酵液，有機(jī)絮凝劑在破碎前預(yù)先加入640ppm，氯化鈣在破碎后加入40mmol/L，并調(diào)節(jié)一定的pH，這樣可將細(xì)微的細(xì)胞碎片粒子聚集起來。絮凝處理的結(jié)果不僅大大改善了離心分離后濾液的澄清度，使細(xì)胞碎片的去除率提高了十倍以上，而且凝固了部分可溶性雜蛋白質(zhì)，濾液總蛋白的含量降低了40％。實(shí)驗(yàn)還證明，在絮凝過程中，β-半乳糖苷酶的活性并沒有受到影響。二、加水稀釋法和加熱法（降低液體粘度的方法）根據(jù)流體力學(xué)原理，濾液通過濾餅的速率與液體的粘度成反比，因此，降低液體的粘度可有效提高過濾速度。常用的方法：加水稀釋法和加熱法。1、加水稀釋法加水一倍，粘度下降50%以上才有效。2、加熱法升高溫度可有效降低液體粘度，提高過濾速率；同時(shí)，使蛋白質(zhì)凝聚，形成較大的凝聚體，進(jìn)一步改善發(fā)酵液的過濾特性。需控制加熱溫度和時(shí)間。

三、調(diào)整pH法（常用方法）

pH直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電解質(zhì)和電荷性質(zhì)，適當(dāng)調(diào)節(jié)pH值可改善其過濾特性。原理：（1）等電點(diǎn)沉淀法大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在酸性范圍內(nèi)（pH4.0-5.5），利用酸性來調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH使之達(dá)到等電點(diǎn)，可除去蛋白質(zhì)等酸性兩性物質(zhì)。（2）在膜過濾中，發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)易于與膜發(fā)生吸附，調(diào)整pH改變易吸附分子的電荷性質(zhì)，減少堵塞和污染。（3）細(xì)胞、細(xì)胞碎片及某些膠體物質(zhì)等在某個(gè)pH值下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于過濾的進(jìn)行。四、加入助濾劑法助濾劑是一種顆粒均勻、質(zhì)地堅(jiān)硬、不可壓縮的惰性粒狀物質(zhì)，用于擴(kuò)大過濾表面的適用范圍，使非常稀薄或非常細(xì)小的懸浮液在過濾時(shí)發(fā)生的快速擠壓和介質(zhì)堵塞現(xiàn)象得到減輕，易于過濾。

硅藻土、纖維素、石棉粉、珍珠巖、淀粉、活性炭等。1、助濾劑使用原理充當(dāng)過濾介質(zhì)的助濾劑表面具有吸附膠體的能力，并且由此助濾劑顆粒形成的濾餅具有格子型結(jié)構(gòu)，不可壓縮，濾孔不會(huì)被全部堵塞，可以保持良好的滲透性，既能使懸浮液中細(xì)小顆粒狀膠態(tài)物質(zhì)截留在格子骨架上，又能使清液有流暢的溝道。懸浮液中大量的細(xì)微膠體粒子被吸附到助濾劑表面上，改變了濾餅的結(jié)構(gòu)，使它的可壓縮性下降，過濾阻力降低。

2、助濾劑的使用助濾劑的使用方法有兩種：

（1）在濾布上預(yù)涂一層助濾劑，作為過濾介質(zhì)使用，待濾畢后與濾餅一起除去；（2）助濾劑按一定比例均勻地混入待濾的發(fā)酵液中，然后一起進(jìn)入過濾機(jī)，使其形成較松的濾餅，降低其可壓縮性，讓濾液可以順暢流通。這兩種方法經(jīng)常同時(shí)使用，以提高過濾速度。選擇和使用助濾劑要點(diǎn)：

（1）根據(jù)目的產(chǎn)物選擇助濾劑品種；（2）根據(jù)過濾介質(zhì)和過濾情況選擇助濾劑品種；（3）助濾劑粒度的選擇；（4）助濾劑使用量的選擇。五、加入反應(yīng)劑法加入某些不影響產(chǎn)物的反應(yīng)劑，可消除發(fā)酵液中某些雜質(zhì)對(duì)過濾的影響，提高過濾速率。反應(yīng)劑和某些可溶性鹽類（如CaSO4、AlPO4等）生成不溶性沉淀，生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，沉淀本身還可作為助濾劑，并能使膠狀物和懸浮物凝固，從而改善過濾性能。六、加吸附劑法或加鹽法該法是將吸附劑加入到細(xì)菌發(fā)酵液中，使菌體吸附在吸附劑上的方法；或用無機(jī)鹽等在發(fā)酵液中形成的大絮狀物把發(fā)酵液中的懸浮粒子吸附在其中，使懸浮粒子沉淀下來，從而大大改善發(fā)酵液的過濾特性。采用的吸附劑：磷酸氫二鈉和氯化鈣形成的CaHPO4凝膠、氧化鋁凝膠、聚丙酰胺凝膠等。

七、高價(jià)無機(jī)離子去除的方法

發(fā)酵液中主要的無機(jī)離子有：Ca2+、Mg2+和Fe3+等。主要影響離子交換樹脂的交換容量。1、鈣離子的去除發(fā)酵液中的鈣離子主要來自培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)鹽成分，常采用酸化劑將其除去。通常使用的酸化劑為草酸以及草酸鈉，形成草酸鈣沉淀。草酸鈣還能使雜蛋白質(zhì)凝固，改善發(fā)酵液的過濾性能。2、鎂離子的去除用三聚磷酸鈉，形成磷酸鎂沉淀，即可消除對(duì)離子交換的影響。（三聚磷酸鈉也可除去鈣離子）3、鐵離子的去除用黃血鹽，形成普魯士藍(lán)沉淀。也可采用加入堿化劑（如NaOH、NH4OH等）生成Fe（OH）3沉淀，同時(shí)也能沉淀部分蛋白質(zhì)。八、可溶性雜蛋白質(zhì)去除的方法對(duì)產(chǎn)品分離過程的危害：（1）直接影響產(chǎn)品質(zhì)量和收得率；（2）雜蛋白質(zhì)產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，使兩相分離不清；（3）雜蛋白質(zhì)使過濾介質(zhì)堵塞或受污染，影響過濾速率。雜蛋白質(zhì)的去除以下常用方法。1、等電點(diǎn)沉淀法利用蛋白質(zhì)兩性物質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，易產(chǎn)生沉淀的性質(zhì)。用酸或堿調(diào)發(fā)酵液pH。2、加熱變性法（最常用）

蛋白質(zhì)從有規(guī)則的排列變成不規(guī)則結(jié)構(gòu)的過程，稱為變性，變性蛋白質(zhì)的溶解度較小。加熱不僅使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)降低液體枯度，提高過濾速率。檸檬酸生產(chǎn)，發(fā)酵液加熱80℃，蛋白質(zhì)變性凝固和降低發(fā)酵液粘度，即可大大提高過濾速率

。3、化學(xué)變性沉淀法使蛋白質(zhì)變性的化學(xué)因素有：極端pH、加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或表面活性劑等。生產(chǎn)常用的方法：（1）調(diào)pH使蛋白質(zhì)變性沉淀如在抗生素生產(chǎn)中，常將發(fā)酵液pH調(diào)至酸性范圍(pH2~3)或堿性范圍(pH8~9)使蛋白質(zhì)凝固，一般以酸性下除去的蛋白質(zhì)較多。（2）加入有機(jī)溶劑、堿金屬中性鹽、表面活性劑等，使蛋白質(zhì)粒子的雙電層破壞，而沉淀。（3）加入化學(xué)試劑pH＜PI，與一價(jià)陰離子形成沉淀；

pH＞PI，與一些陽離子形成沉淀蛋白質(zhì)在酸性溶液中，與陰離子（三氯乙酸鹽等）形成沉淀；在堿性溶液中，與陽離子（Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Pb2+）形成沉淀。變性法存在一定的局限性。如加熱法只適合于對(duì)熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端pH也會(huì)導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，并且要消耗大量酸堿；而有機(jī)溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場(chǎng)合。

4、吸附法加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質(zhì)而除去。例如在枯草芽抱桿菌發(fā)酵液中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，從而可加快過濾速率。九、色素及其他雜質(zhì)去除的方法常用脫色方法：離子交換和活性炭吸附等方法。第三節(jié)發(fā)酵液固液分離及設(shè)備一、發(fā)酵液固液分離的方法發(fā)酵液的固液分離是指用過濾、離心等手段除去發(fā)酵液中的懸浮固體（如菌體、細(xì)胞、細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)及其絮凝體）的過程。1、發(fā)酵液固液分離的目的產(chǎn)物或是胞內(nèi)或是胞外。（1）為獲得含所需產(chǎn)物的細(xì)胞（菌絲體）或發(fā)酵液；（2）為除去發(fā)酵液中的固形雜質(zhì)。2、影響發(fā)酵液固液分離的因素（1）菌種：決定發(fā)酵液中各種懸浮粒子的大小和形狀；（2）發(fā)酵液黏度：發(fā)酵條件（pH、溫度）培養(yǎng)基成分、發(fā)酵時(shí)間、雜菌污染、消泡劑等。

3、發(fā)酵液固液分離的方法發(fā)酵液固液分離的主要方法：過濾和離心分離。不同性狀的發(fā)酵液應(yīng)選擇不同的固液分離方法和設(shè)備。霉菌和放線菌（細(xì)胞體積較大的絲狀菌）：過濾；細(xì)菌和酵母菌：高速離心機(jī)分離；發(fā)酵液采用絮凝和添加助濾劑預(yù)處理后，也可過濾。二、離心分離及設(shè)備離心分離是指在離心場(chǎng)的作用下，將懸浮液中的固相和液相加以分離的方法。離心分離主要用于顆粒較細(xì)的懸浮液和乳濁液的分離。離心分離的方法按照離心原理的不同分為：差示離心、均勻介質(zhì)離心、密度梯度離