h17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性細(xì)胞在實驗性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病過程中的作用

多發(fā)性硬化（ms）是一種具有自身免疫性疾病，具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥損傷、軸向退化和白質(zhì)脫髓鞘炎等特征。由于MS病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。17型輔助性T細(xì)胞(helperTcelltype17,Th17)是一種以分泌細(xì)胞因子IL-17為主的T細(xì)胞亞群,參與自身免疫性疾病的病理過程,而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoryTcells,Treg)主要在體內(nèi)發(fā)揮免疫負(fù)向調(diào)節(jié)作用,對過度及錯誤的免疫應(yīng)答進(jìn)行限制。Th17細(xì)胞/Treg平衡對維持正常免疫應(yīng)答,防止自身免疫反應(yīng)具有重要作用,Th17/Treg失衡將會導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。深入研究Th17細(xì)胞/Treg平衡、失衡機(jī)制,揭示其對自身免疫性疾病發(fā)病和治療的意義具有重要價值,實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis,EAE)是研究MS免疫病理學(xué)經(jīng)典的動物模型。在本實驗中我們參照Stromnes等造模方法,建立EAE小鼠模型,通過檢測Th17細(xì)胞和Treg的相關(guān)指標(biāo)來探討Th17細(xì)胞/Treg失衡在EAE中所扮演的角色,為MS發(fā)病機(jī)制的闡明提供實驗依據(jù)。1材料和方法1.1實驗試劑和檢測試劑盒54只10~12周近交系健康清潔級雌性C57BL/6小鼠,體質(zhì)量18~20g;在室溫22~25℃、相對濕度50%~70%、小鼠能自由攝食及飲水。適應(yīng)飼養(yǎng)1周后予以隨機(jī)分組。免疫原MOG35~55多肽(MEVGWYRSPFSRV-VHLYRNGK),純度HPLC>99%購自上海生工公司;Freund完全佐劑(completeFreund’sadjuvant,CFA)、百日咳毒素(pertussistoxin,PT)購自Sigma公司;TRIzol試劑購自Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR(realtimequantitativePCR,qRT-PCR)檢測試劑盒購自大連TaKaRa公司;小鼠CD4、CD25、Foxp3Treg標(biāo)記試劑盒、同型對照PE標(biāo)記的大鼠Ig2bκ及透膜緩沖液均購自BD公司;ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德公司。FACScan流式細(xì)胞儀為BD公司產(chǎn)品,Lightcycle480熒光定量PCR儀為Roche公司產(chǎn)品,680S酶標(biāo)儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品。1.2小鼠eae模型的建立EAE組(n=30,小鼠雙側(cè)腹股溝皮下注射MOG300μg、100μLPBS、100μLCFA混合乳液);CFA對照組(n=24,小鼠雙側(cè)腹股溝皮下注射100μLPBS、100μLCFA混合乳液)。并于當(dāng)天和48h后腹腔內(nèi)注射百日咳毒素稀釋液(400ng/100μL),免疫后每天稱量體質(zhì)量,連續(xù)觀察30d,并按Ingunn評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分:1分:尾部無力,2分:運動不協(xié)調(diào)伴后肢無力,2.5分:后肢癱瘓,3分:雙后肢癱瘓,3.5分:雙后肢癱瘓伴前肢無力,4分:前肢癱瘓,5分:垂死狀態(tài)。共免疫30只小鼠,選擇發(fā)病后的小鼠24只,根據(jù)臨床癥狀各組又分為發(fā)病初期(n=8)、高峰期(n=8)和慢性期(n=8)。采用HE和固綠髓鞘染色方法證實EAE模型的建立。取發(fā)病高峰期EAE組和佐劑對照組小鼠腦和脊髓組織制備病理切片,送協(xié)和醫(yī)院病理科檢測。無菌條件下取EAE組和佐劑對照組小鼠脾臟,研磨分離出淋巴細(xì)胞,用0.01mol/LPBS緩沖液洗滌3次后重懸細(xì)胞,細(xì)胞計數(shù),取約1×106個細(xì)胞,加入FITC標(biāo)記的CD4抗體和PE標(biāo)記的CD25抗體各2μL,同型對照加入PE標(biāo)記的大鼠Ig2bκ2μL,4℃下孵育60min。PBS洗滌后,加入1mL的固定破膜工作液作用4℃下孵育60min。加入2mL透膜緩沖液離心洗滌細(xì)胞并棄去上清液。加入AlexaFluorue4d1647標(biāo)記的Foxp3抗體10μL,4℃下孵育30min。加入2mLPBS洗滌細(xì)胞后,用0.5mLPBS緩沖液重懸細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測,以CD4+細(xì)胞設(shè)門,檢測CD25+Foxp3+Treg。所采用的反應(yīng)條件為:95℃30s,1個循環(huán);95℃5s,62℃30s,40個循環(huán);95℃1s,60℃15s,40℃1s。結(jié)果采用RocheMolecular進(jìn)行分析根據(jù)2-△△CT法計算基因相對表達(dá)量。采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,2組比較采用LSD檢驗,多組均數(shù)比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1大鼠模型的構(gòu)建2.1.1發(fā)病期組織he染色結(jié)果與本課題組前期結(jié)果一致,佐劑對照組小鼠腦和脊髓的病理切片則未見明顯改變(圖2A),而在EAE組小鼠發(fā)病高峰期腦組織HE染色結(jié)果顯示(圖2B),在血管周圍出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤,呈血管袖套樣改變,浸潤細(xì)胞主要為淋巴細(xì)胞,亦可見少量膠質(zhì)細(xì)胞。腦膜和脊膜也可發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(圖2C)。疾病高峰期,固綠髓鞘染色結(jié)果(圖2D)顯示髓鞘脫失呈局灶性,多位于小血管旁。其病理學(xué)變化表明成功建立了EAE模型。2.2ror-tmna的表達(dá)結(jié)果顯示與佐劑對照組比較,在EAE組發(fā)病初期小鼠脾淋巴細(xì)胞RoR-γtmRNA的表達(dá)量明顯升高,且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖3),但在發(fā)病的高峰期及慢性期與佐劑對照組比較,RoR-γtmRNA表達(dá)則無顯著變化(P>0.05)。Foxp3mRNA在EAE組發(fā)病初期及高峰期的表達(dá)量與佐劑對照組比較明顯減少(P<0.05),而慢性期較佐劑對照組表達(dá)增加(P<0.05)。2.3慢性期及慢期組il-17mrna表達(dá)比較在EAE發(fā)病的不同時期,小鼠腦組織上IL-17mRNA的表達(dá)與相應(yīng)的佐劑對照組比較明顯上調(diào)(P<0.05,圖4)。進(jìn)一步對在EAE發(fā)病的不同時期IL-17mRNA的表達(dá)進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn),在EAE發(fā)病高峰期IL-17mRNA的表達(dá)最高,與發(fā)病初期組和慢性期相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);在慢性期,IL-17mRNA的表達(dá)有所降低,與高峰期組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而與發(fā)病初期組相比,無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ELISA檢測發(fā)現(xiàn),在EAE發(fā)病初期、高峰期及慢性期血清中IL-17A分別為(11.50±1.30)ng/mL、(16.92±1.87)ng/mL、(13.81±1.08)ng/mL,與各自相應(yīng)的佐劑對照組比較,小鼠血清中IL-17A濃度在EAE組發(fā)病各期均有明顯升高(P<0.05)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),與發(fā)病初期和慢性期相比,在EAE發(fā)病高峰期IL-17濃度最高(P<0.05,圖4);在慢性期,IL-17濃度有所降低,與高峰期組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而與發(fā)病初期組相比,無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。2.4慢性期小鼠脾臟cd4+cd5+treg的變化流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),在EAE組發(fā)病初期和高峰期小鼠脾細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg數(shù)量降低,與佐劑對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖5),EAE組慢性期中小鼠脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg則明顯升高,與佐劑對照組比較差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),與發(fā)病初期組和慢性期相比,在EAE高峰期小鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg數(shù)量最低(P<0.05);在慢性期,小鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg數(shù)量明顯升高,約為高峰期的10倍,與發(fā)病初期組和高峰期組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2.5小鼠血清中tgf-、il-6、tgf-的變化情況ELISA檢測結(jié)果顯示,小鼠血清中TGF-β濃度在EAE發(fā)病初期、高峰期及慢性期分別為(8.61±0.29)ng/mL、(8.15±0.53)ng/mL、(7.66±0.28)ng/mL;與相應(yīng)佐劑對照組比較,小鼠血清中TGF-β濃度在EAE組發(fā)病各期均有明顯升高,且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。IL-6濃度在EAE組發(fā)病初期、高峰期及慢性期小鼠血清中分別為(186.25±26.40)pg/mL、(149.80±19.44)pg/mL、(101.25±17.98)pg/mL,與相應(yīng)佐劑對照組比較,小鼠血清中IL-6濃度在EAE組發(fā)病初期和高峰期有明顯升高,且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而在慢性期,小鼠血清中IL-6濃度有所下降,且與佐劑對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。隨著EAE疾病發(fā)展,IL-6濃度逐漸降低(圖6)。3eae發(fā)病時期th17和treg失衡的變化MS是發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前仍未完全闡明。EAE是研究MS的經(jīng)典動物模型。本實驗中我們首先用人工合成MOG35-55多肽成功建立EAE模型,接下來以EAE模型為基礎(chǔ),探討Th17細(xì)胞/Treg失衡在EAE發(fā)病中的作用,為MS發(fā)病機(jī)制的闡明提供實驗依據(jù)。Foxp3是Treg細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)因子,RoR-γt是Th17細(xì)胞活化所必需的轉(zhuǎn)錄因子,Foxp3或RoR-γt增加會促進(jìn)Treg或Th17細(xì)胞的分化。本研究發(fā)現(xiàn),RoR-γtmRNA表達(dá)在EAE發(fā)病初期明顯增強(qiáng),在發(fā)病的高峰期及慢性期變化不明顯;Foxp3在EAE發(fā)病初期及高峰期表達(dá)降低,在慢性期Foxp3表達(dá)升高。以上結(jié)果提示在EAE發(fā)病過程可能存在Th17/Treg失衡。為進(jìn)一步驗證在EAE發(fā)病不同時期Th17和Treg失衡的狀態(tài),我們檢測了IL-17在腦組織和外周血中含量變化,結(jié)果顯示IL-17的表達(dá)在EAE發(fā)病各期均高表達(dá),且IL-17表達(dá)的最高峰與疾病發(fā)病高峰期相一致,這一結(jié)果提示在EAE的發(fā)病過程中(特別是初期和高峰期)Th17功能亢進(jìn),也進(jìn)一步說明Th17參與了EAE的發(fā)病過程。接下來流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),在EAE發(fā)病不同時期脾臟中Treg細(xì)胞比例的變化,在EAE發(fā)病初期、高峰期Treg比例明顯降低,而在慢性期Treg比例顯著升高。以上結(jié)果提示,EAE發(fā)病過程中確實存在Th17/Treg失衡:在發(fā)病初期及高峰期Th17/Treg平衡向Th17傾斜,Th17功能亢進(jìn),Treg功能低下,而隨著疾病的發(fā)展,可能是由于抗原刺激的減弱或機(jī)體自身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生反饋作用,使Treg數(shù)量增加,發(fā)揮抑制炎癥的功能,Th17功能減弱,從而使疾病進(jìn)入慢性期。那么引起Th17/Treg失衡的機(jī)制是什么呢?目前已知,TGF-β和IL-6是Th17和Treg分化過程中關(guān)鍵的調(diào)控因子,CD4+T細(xì)胞向Th17或向Treg分化是互相排斥的,在高濃度的TGF-β和IL-6的共同誘導(dǎo)下分化為Th17,參與炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病;但在缺乏IL-6時,單獨高濃度的TGF-β情況下,CD4+T細(xì)胞向Treg分化。我們的結(jié)果顯示,在發(fā)病初期EAE小鼠血清中含有高濃度的TGF-β和IL-6,而在慢性期TGF-β濃度仍然保持高濃度而IL-6濃度隨著疾病的發(fā)展逐漸降低,在慢性期降低到機(jī)體的生理水平。通過這一結(jié)果可以推測在EAE發(fā)病初期高濃度的TGF-β和IL-6可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子ROR-γtmRNA活化,從而誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化,促進(jìn)IL-17等細(xì)胞因子的分泌,導(dǎo)致炎癥的發(fā)生;而Treg細(xì)胞的數(shù)量在EAE發(fā)病高峰期時降到最低,免疫負(fù)向調(diào)節(jié)減弱,所以EAE鼠評分達(dá)到最高分,癥狀也最嚴(yán)重,隨著外周血的IL-6濃度下降,Th17細(xì)胞產(chǎn)生減少,Treg數(shù)量逐漸上調(diào),故在慢性期EAE小鼠癥狀有所緩解。綜上所述,本研究表明Th17/Treg失衡參與了EAE的發(fā)病過程,彌補(bǔ)了Th1/Th2介導(dǎo)效應(yīng)機(jī)制的不足,豐富了多發(fā)性硬化的免疫應(yīng)答調(diào)控機(jī)制理論。對Treg/Th17平衡機(jī)制的深入研究為進(jìn)一步揭示MS的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,尋找有效的MS治療方法提供思路。1.1.1實驗大鼠1.1.2試劑1.1.3儀器1.2.1大鼠模型的構(gòu)建1.2.2流式細(xì)胞培養(yǎng)檢測aee大鼠脾臟中cd4、cd25、fup3和treg細(xì)胞的情況1.2.3rna提取及實時熒光定量pcr檢測無菌條件下取EAE組和佐劑對照組小鼠脾臟,研磨分離出淋巴細(xì)胞用TRIzol法來獲得RNA,無菌條件下取EAE組和佐劑對照組小鼠腦組織通過液氮勻漿后采用TRIzol法來獲得RNA,利用逆轉(zhuǎn)錄試劑將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,通過熒光實時定量PCR儀進(jìn)行檢測。引物序列詳見表1。1.2.4elisa檢測各組各期小鼠于相應(yīng)的時間點,摘除眼球,使血液自然流出(防止溶血),滴于1.5mLEP管中,室溫靜置30min,3000r/min離心20min,吸取上層血清,按照ELISA試劑說明書進(jìn)行檢測。1.2.5臨床評分的動態(tài)變化與本課題組前期結(jié)果一致,佐劑對照組沒有1只發(fā)病,EAE模型組發(fā)病率為80%,30只小