臨床科研設(shè)計和SCI論文策略---RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用

湖南省生物醫(yī)學(xué)信息專業(yè)委員會長沙贏潤生物技術(shù)有限公司講座提綱一.科研選題及設(shè)計：以SCI為目標(biāo)二.臨床樣本在基因功能研究中的作用三.RNA干擾技術(shù)在基因功能研究中的應(yīng)用四.RNA干擾技術(shù)在發(fā)表SCI論文中的應(yīng)用一.科研選題及設(shè)計：以SCI為目標(biāo)SCI沒有捷徑，但是有小技巧和經(jīng)驗。閱讀文獻(xiàn)是基礎(chǔ)，必不可少。他山之石，可以攻玉。參考前人的經(jīng)驗，獲得自己的Idea。如何選題部位前人的經(jīng)驗：發(fā)現(xiàn)某基因在肝癌組織中表達(dá)增高，并有很多機(jī)制。

我們的借鑒：拜讀大作后，茅塞頓開。查文獻(xiàn)后，確定在乳腺癌中尚無人涉及，于是，SCI處女作出爐：某基因在乳腺癌組織中表達(dá)增高。

注：全身器官那么多，你只要看文獻(xiàn)比較及時，比較多，不太晚，總能找到合適的方向。藥物

前人的經(jīng)驗：發(fā)現(xiàn)辛伐他汀有某種作用，能夠治療某種臨床疾病，且對其原理進(jìn)行了研究，找到了相關(guān)基因。

我們的借鑒：拜讀大作后，聯(lián)想到了阿托伐他汀，于是SCI處女作出爐：阿托伐他汀對某疾病的治療效果及其作用機(jī)制。

注：同一類的藥物有那么多種，您完全可以換一種藥物拿來做一下試試。

機(jī)制

前人的經(jīng)驗：發(fā)現(xiàn)某基因具有抗氧化應(yīng)激的作用。

我們的借鑒：拜讀大作后，聯(lián)想到氧化應(yīng)激在好多疾病的病理機(jī)制中都發(fā)揮作用，比如糖尿病腎病、糖尿病神經(jīng)病變等等，于是SCI處女作出爐：某基因在糖尿病腎病中的作用。

注：注意串聯(lián)聯(lián)想：基因機(jī)制臨床疾病基因上下游基因

前人的經(jīng)驗：發(fā)現(xiàn)A基因具有某種作用。

我們的借鑒：拜讀大作后，聯(lián)想到A基因的上游或下游基因是B基因，是否也有這種作用？于是SCI處女作出爐：B基因具有某種作用。

注：需要一定的知識基礎(chǔ)，但相對于機(jī)制來說簡單一點。

家族基因或者相同作用的基因前人的經(jīng)驗：發(fā)現(xiàn)某種藥物能夠?qū)NF-α產(chǎn)生影響。

我們的借鑒：拜讀大作后，聯(lián)想到IL-6以及CRP都是炎癥因子，有可能這種藥物對IL-6以及CRP也有影響，于是SCI處女作出爐：某種藥物對IL-6以及CRP的影響。

注：有相同作用的基因有很多，注意聯(lián)想。

如何設(shè)計自己的課題不要把實驗設(shè)計得過廣。只要在一點上面做得稍微有深度就行了。不要用一個實驗來證明N個結(jié)論，而是要用N個實驗來證明一個結(jié)論---即使這幾個實驗都比較簡單。做出深度，做出層次來。

二.臨床樣本在基因功能研究中的作用確定目的基因和臨床疾病之間的關(guān)系確定目的microRNA和臨床疾病之間的關(guān)系通常是整個課題的起始收集臨床樣本RNADNAProteinmicroRNA芯片基因芯片組織芯片RT-PCR或Real-timePCRWestern-blot免疫組化基因表達(dá)差異確定目的基因參考文獻(xiàn)microRNA研究二.臨床樣本在基因功能研究中的作用確定預(yù)研究的目的基因后，如何設(shè)計課題？基因功能研究的兩方面：A.基因的過表達(dá)---基因表達(dá)上調(diào)；B.基因的RNA干擾---基因表達(dá)下調(diào)。兩者相輔相成，互為佐證。緊貼臨床疾病的基因治療這一目的。

三.RNA干擾技術(shù)在基因功能研究中的應(yīng)用3.1靶位點的選擇&shRNA序列設(shè)計3.2

shRNA表達(dá)載體構(gòu)建3.3篩靶：確定最有效的shRNA3.4轉(zhuǎn)染或感染目的細(xì)胞，表達(dá)shRNA3.5檢測或驗證RNA干擾效果3.6RNA干擾回復(fù)實驗3.7動物模型實驗RNA干擾實驗流程圖尋找靶位點，設(shè)計干擾序列確定靶基因參考文獻(xiàn)收集標(biāo)本，比較基因表達(dá)差異參考文獻(xiàn)或文庫設(shè)計全新序列將shRNA片段裝載至表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞，表達(dá)shRNA普通質(zhì)粒載體病毒載體檢測或驗證RNA干擾效果外源篩靶mRNA水平蛋白質(zhì)水平細(xì)胞表型水平動物模型預(yù)實驗：確定目的細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率包裝病毒體外法體內(nèi)法RNA干擾回復(fù)實驗3.1靶位點的選擇&shRNA序列設(shè)計非常重要的一步！事半功倍or事倍功半？現(xiàn)有免費軟件設(shè)計：成功率較低（30%左右）商業(yè)化軟件或shRNA庫：成功率高（75%以上）YrbioshRNA庫讓您的RNAi實驗有一個良好的起點！真正做到事半功倍！包含TRC、Ambion等多個組織或機(jī)構(gòu)開發(fā)的shRNA庫；針對人及小鼠數(shù)萬個基因，每個基因提供3~5條shRNA；庫中shRNA有效率高達(dá)75%！大部分shRNA干擾效率超過80%！推薦3.2

shRNA表達(dá)載體構(gòu)建TRC原裝進(jìn)口shRNA表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點：（1）原裝進(jìn)口產(chǎn)品，本公司未做任何改動。（2）既可當(dāng)作普通shRNA真核表達(dá)載體使用，同時也是慢病毒包裝系統(tǒng)中的穿梭載體，可以用來包裝慢病毒。缺點：（1）載體上沒有熒光標(biāo)記。（2）慢病毒的生物安全性，對實驗室條件要求較高。（3）載體拷貝數(shù)較低，測序比較困難。贏潤shRNA表達(dá)系統(tǒng)（1）shRNA序列數(shù)據(jù)依然來自TRC、AmbionshRNA數(shù)據(jù)庫，質(zhì)量有保證，靶位點成功率高。（2）您可以選擇構(gòu)建一條或者多條shRNA，靈活度高。（3）多種啟動子，有熒光或無熒光，綠色熒光或紅色熒光等可自由選擇，能夠更好地配合后續(xù)實驗。（4）載體既可作為普通shRNA表達(dá)載體使用，亦可作為腺病毒或慢病毒包裝系統(tǒng)的穿梭載體使用，以進(jìn)行腺病毒或慢病毒包裝。3.2

shRNA表達(dá)載體構(gòu)建mirshRNA表達(dá)載體3.3篩靶：確定最有效的shRNA內(nèi)源篩靶、外源篩靶什么情況下采用外源篩靶？（1）目的細(xì)胞暫時不易得到；（2）目的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低（小于60%）；（3）目的細(xì)胞需誘導(dǎo)才能表達(dá)靶基因；（4）目前尚無靶基因的抗體。3.3篩靶：確定最有效的shRNA由于上述原因，研究者可以在非常容易轉(zhuǎn)染的的細(xì)胞株（即所謂工具細(xì)胞）中進(jìn)行“RNAi有效靶點篩選”工作。常用的工具細(xì)胞有HEK293、CHO、NIH3T3等。如果您的目的細(xì)胞很容易轉(zhuǎn)染，那么可以直接在你的目的細(xì)胞中進(jìn)行siRNA篩靶工作。3.4轉(zhuǎn)染或感染目的細(xì)胞，表達(dá)shRNA通過預(yù)實驗確定目的細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率方法：實驗室現(xiàn)有轉(zhuǎn)染條件下，轉(zhuǎn)染一熒光載體（例如pEGFP-N1）至目的細(xì)胞中，通過觀察熒光，判斷目的細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。原理：影響細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的主要因素為：（1）細(xì)胞類型；（2）轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染條件；質(zhì)粒的影響因素很小。3.4轉(zhuǎn)染或感染目的細(xì)胞，表達(dá)shRNA如果目的細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低（小于60%）：腺病毒載體：高轉(zhuǎn)染效率、高表達(dá)效率、使用方便。約85%的基因治療臨床項目采用的均是病毒載體（其中將近一半使用的是腺病毒載體）。腺病毒包裝體系A(chǔ)deasy系統(tǒng)：利用細(xì)菌重組；重組率較高，病毒滴度低。Admax系統(tǒng)：Cre/loxP，293細(xì)胞內(nèi)重組，同源重組率較低。

Adeno-X系統(tǒng)：PI-SceⅠ、I-CeuⅠ酶切連接。

BLOCK-iT?AdenoviralRNAiExpressionSystem：Invitrogen，GatewayLR體外重組技術(shù)。重組效率高，快速簡單，篩選方便；對感受態(tài)要求較高；載體較貴。推薦慢病毒包裝體系三質(zhì)粒系統(tǒng)四質(zhì)粒系統(tǒng)慢病毒表達(dá)載體、gag/pol、REV、VSV-G慢病毒表達(dá)載體4.5檢測或驗證RNA干擾效果mRNA水平：RT-PCR、Real-timePCR蛋白質(zhì)水平：Western-blot、免疫熒光細(xì)胞表型水平：

Hoechst33258染色（細(xì)胞凋亡）；

DAPI（細(xì)胞凋亡）；TUNEL（細(xì)胞凋亡）；

MTT（細(xì)胞增殖）；流式細(xì)胞檢測（細(xì)胞周期與凋亡）；細(xì)胞小室實驗（細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力）4.6RNA干擾回復(fù)實驗RNA干擾中的Off-target既脫靶效應(yīng)由于序列同源性（11~15個核苷酸）而引起的非特異性干擾。解決方案：設(shè)計、篩選2~3個有效的shRNA進(jìn)行實驗?；蛘咦鯮NA干擾回復(fù)實驗。按照Nature的標(biāo)準(zhǔn)，一個嚴(yán)格的RNAi實驗要有6個對照：（1）轉(zhuǎn)染試劑對照（監(jiān)控轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)條件對結(jié)果的影響）；（2）nonsensesiRNA對照（監(jiān)控外源核酸本身對結(jié)果的影響）；（3）positivesiRNA對照（監(jiān)控假陰性）；（4）技術(shù)重復(fù)對照（也叫off-target對照，也就是利用至少2個靶點的siRNA同時實驗，2個siRNA互為off-targetcontrol，當(dāng)兩者的表型相同時，才有可能是特異性的RNAi效應(yīng)）；（5）rescue對照（RNAi之后做過表達(dá)，看是否有性狀的逆轉(zhuǎn)，這也是為了說明RNAi的特異性）；（6）全表達(dá)組掃描對照（轉(zhuǎn)錄/表達(dá)芯片掃描，以最終確定表型不是由于off-target造成）。如何進(jìn)行RNA干擾回復(fù)實驗細(xì)胞：目的細(xì)胞質(zhì)粒或病毒：shRNA表達(dá)質(zhì)?；虿《?；目的基因過表達(dá)質(zhì)?；虿《痉椒ǎ篈.先干擾靶基因，再過表達(dá)目的基因（WT）；B.共轉(zhuǎn)染：①shRNA表達(dá)質(zhì)?；虿《劲谀康幕颍∕T）表達(dá)質(zhì)?；虿《就扑]3.7動物模型實驗體外法：先將質(zhì)?；虿《緦?dǎo)入目的細(xì)胞，再將目的細(xì)胞導(dǎo)入動物體內(nèi)。優(yōu)點：易操作缺點：不能完全模擬天然環(huán)境體內(nèi)法：直接將質(zhì)?；虿《緦?dǎo)入動物體內(nèi)。優(yōu)點：環(huán)境更真實缺點：不易操作推薦四.RNA干擾技術(shù)在發(fā)表SCI論文中的應(yīng)用研究實例一：IF0.8研究實例二：IF3研究實例三：IF7.5研究實例四：IF4.7

研究實例一影響因子：0.8分MethodsshRNA細(xì)胞