從社會中來2.2動物細(xì)胞工程主備人：彭榜元一、動物細(xì)胞培養(yǎng)概念：動物細(xì)胞培養(yǎng)是指從動物體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個細(xì)胞，然后在適宜的培養(yǎng)條件下，讓這些細(xì)胞生長和增殖的技術(shù)。一、動物細(xì)胞培養(yǎng)﹤動物細(xì)胞培養(yǎng)所需的基本條件﹤營養(yǎng)條件其他條件糖類、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素……適宜的溫度、pH和滲透壓無菌、無毒的環(huán)境適宜的氣體環(huán)境任務(wù)一：動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件1.營養(yǎng)①已知成分:將細(xì)胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)按種類和所需量嚴(yán)格配制的培養(yǎng)基，稱為合成培養(yǎng)基。②未知成分：使用合成培養(yǎng)基時，通常需加入血清等一些天然成分。血清中含有人類尚未全部研究清楚、細(xì)胞生長和增殖所必需的物質(zhì)。培養(yǎng)皿培養(yǎng)瓶+合成培養(yǎng)基血清任務(wù)一：動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件2.無菌、無毒的環(huán)境無菌①對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進(jìn)行滅菌處理②在無菌環(huán)境下進(jìn)行操作定期更換培養(yǎng)液，以便清除代謝物無毒（防止細(xì)胞代謝物積累對細(xì)胞自身造成危害。）①濕熱滅菌②干熱滅菌③灼燒滅菌任務(wù)一：動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件3.溫度、pH和滲透壓（1）哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的溫度多以36.5±0.5℃為宜。（2）多數(shù)動物細(xì)胞生存的適宜pH為7.2-7.4。（3）維持細(xì)胞正常的形態(tài)和功能。任務(wù)一：動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件4.氣體環(huán)境O2：細(xì)胞代謝所必需的。CO2：主要作用是維持培養(yǎng)液的pH。通常采用培養(yǎng)皿或松蓋培養(yǎng)瓶。并將它們置于含有95%空氣和5%CO2的混合氣體的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。CO2培養(yǎng)箱任務(wù)二：動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程①取動物組織用機(jī)械的方法，或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理的方法，將組織分散成單個細(xì)胞②分散組織細(xì)胞蛋白質(zhì)；不行，多數(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)的適宜pH為7.2-7.4；胃蛋白酶作用的適宜pH為2，當(dāng)pH大于6時，胃蛋白酶會失去活性。任務(wù)二：動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程①取動物組織用機(jī)械的方法，或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理的方法，將組織分散成單個細(xì)胞②分散組織細(xì)胞③制成細(xì)胞懸液④轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)培養(yǎng)皿⑤放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)單層生長的肝細(xì)胞（100×）任務(wù)二：動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程①取動物組織用機(jī)械的方法，或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理的方法，將組織分散成單個細(xì)胞②分散組織細(xì)胞③制成細(xì)胞懸液④轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)培養(yǎng)皿⑤放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)⑥分瓶培養(yǎng)原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)任務(wù)二：動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程任務(wù)二：動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程

細(xì)胞的增殖能力與供體的年齡有關(guān)，幼齡動物的細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，有絲分裂旺盛，老齡動物的細(xì)胞則相反。所以，一般來說，幼齡動物的細(xì)胞比老齡動物的細(xì)胞易于培養(yǎng)。同樣，分化程度越低的細(xì)胞，增殖能力越強(qiáng)，所以更容易培養(yǎng)。植物組織培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)基的物理性質(zhì)結(jié)果是否體現(xiàn)細(xì)胞的全能性相同點(diǎn)植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞增殖固體液體(又稱培養(yǎng)液)一般獲得新的植株獲得大量細(xì)胞是否①培養(yǎng)過程中細(xì)胞都進(jìn)行有絲分裂，不涉及減數(shù)分裂；②均需無菌操作，需要適宜的溫度、pH等條件。任務(wù)三：干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用1.干細(xì)胞概念：動物和人體內(nèi)仍保留著少數(shù)具有分裂和分化能力的細(xì)胞，這些細(xì)胞叫作干細(xì)胞。2.干細(xì)胞分布：存在于早期胚胎、骨髓、外周血和臍帶血等多種組織和器官中。任務(wù)三：干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用3.干細(xì)胞分類：根據(jù)來源胚胎干細(xì)胞成體干細(xì)胞：簡稱ES細(xì)胞，存在于早期胚胎中，具有分化為成年動物體內(nèi)的任何一種類型的細(xì)胞，并進(jìn)一步形成機(jī)體的所有組織和器官甚至個體的潛能。：成體組織或器官內(nèi)的干細(xì)胞，包括骨髓中的造血干細(xì)胞、神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)干細(xì)胞和睪丸中的精原干細(xì)胞等。一般認(rèn)為，成體干細(xì)胞具有組織特異性，只能分化成特定的細(xì)胞或組織，不具有發(fā)育成完整個體的能力。任務(wù)三：干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用4.干細(xì)胞的應(yīng)用：有著自我更新能力及分化潛能的干細(xì)胞，與組織、器官的發(fā)育、再生和修復(fù)等密切相關(guān)，因而在醫(yī)學(xué)上有著廣泛的應(yīng)用。造血干細(xì)胞移植治療白血病及一些惡性腫瘤放療或化療后引起的造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)功能障礙等疾病；神經(jīng)干細(xì)胞在治療神經(jīng)組織損傷和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。ㄈ缗两鹕?、阿爾茨海默病等）胚胎干細(xì)胞必須從胚胎中獲取，這涉及倫理問題，因而限制了它在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。任務(wù)三：干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用5.誘導(dǎo)多能干細(xì)胞：通過多種技術(shù)手段誘導(dǎo)相應(yīng)體細(xì)胞，獲得類似胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞，將它稱為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）

來源或存在功能、特點(diǎn)局限性胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)成體干細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)早期胚胎能夠分化成為動物體內(nèi)的任何細(xì)胞，并進(jìn)一步形成組織、器官甚至生物個體成體組織或器官，如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和精原干細(xì)胞等體外誘導(dǎo)體細(xì)胞產(chǎn)生能分化成為具有特定功能的細(xì)胞來治療疾病。無須破壞胚胎，且避免免疫排斥反應(yīng)。具有組織特異性，能分化成特定的細(xì)胞或組織不具有發(fā)育成完整個體的能力需從胚胎中獲取，涉及倫理問題，限制了它在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用技術(shù)不成熟。課后習(xí)題二、動物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體若將A、B細(xì)胞都換成動物細(xì)胞，這一過程可行嗎？任務(wù)一：動物細(xì)胞融合技術(shù)這一過程體現(xiàn)了細(xì)胞膜的什么特性？什么是細(xì)胞融合？任務(wù)一：動物細(xì)胞融合技術(shù)1.概念：動物細(xì)胞融合技術(shù)就是使兩個或多個動物細(xì)胞結(jié)合形成一個細(xì)胞的技術(shù)。2.結(jié)果：形成的雜交細(xì)胞具有原來兩個或多個細(xì)胞遺傳信息的。思考：這個結(jié)果和植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的結(jié)果有什么不同？任務(wù)一：動物細(xì)胞融合技術(shù)3.誘導(dǎo)方法：物理法：化學(xué)法：生物法：電融合法聚乙二醇（PEG)與植物原生質(zhì)體融合的方法相同滅活的病毒動物特有任務(wù)一：動物細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞核病毒顆粒滅活的病毒黏附于細(xì)胞表面細(xì)胞膜互相凝聚細(xì)胞膜融合，細(xì)胞質(zhì)流通形成雜交細(xì)胞融合實(shí)質(zhì)及完成的標(biāo)志19世紀(jì)30年代，科學(xué)家曾在肺結(jié)核、天花和麻疹等疾病的病人的病理組織中觀察到多核細(xì)胞。如何解釋這一現(xiàn)象？病人體內(nèi)的病毒等誘導(dǎo)多個體細(xì)胞融合形成了多核細(xì)胞。任務(wù)一：動物細(xì)胞融合技術(shù)4.意義：突破了有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。5.應(yīng)用：①至今，種間、屬間、科間，甚至動物和植物之間的細(xì)胞融合都已獲得成功。②研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。③為制造單克隆抗體開辟了新途徑。植物體細(xì)胞雜交動物細(xì)胞融合原理細(xì)胞融合前的處理方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法細(xì)胞融合成功的標(biāo)志意義主要用途細(xì)胞膜具有一定的流動性、植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜具有一定的流動性用果膠酶和纖維素酶去除細(xì)胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細(xì)胞分散成單個細(xì)胞聚乙二醇（PEG）融合法、電融合法、離心法；高Ca2+-高pH融合法聚乙二醇（PEG）融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法再生出細(xì)胞壁細(xì)胞核的融合打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能獲得完整的雜種植株主要用于制造單克隆抗體做核酸：這個場景大家再熟悉不過了居家隔離不能出去做核酸怎么檢測？任務(wù)二：單克隆抗體及其應(yīng)用思考：為了保證抗原檢測的準(zhǔn)確性并讓每個人都用得起，對于所用抗體必須滿足什么條件？①抗體的特異性極高；②制備抗原的成本低（產(chǎn)量高）。血清抗體主要分布在哪里？思考：據(jù)此，你認(rèn)為可以怎樣制備抗體？向動物體內(nèi)反復(fù)注射某種抗原，使動物產(chǎn)生抗體，然后從動物血清中分離所需抗體。缺陷：產(chǎn)量低、純度低，特異性差。傳統(tǒng)方法制備抗體抗體1抗體2抗體3抗體4…….動物體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體的種類超過百萬種抗原1抗原2抗原3抗原4B細(xì)胞1B細(xì)胞2B細(xì)胞3B細(xì)胞4…….刺激刺激刺激刺激思考：若我們只需要大量的抗體1有什么辦法嗎？B細(xì)胞1抗體1細(xì)胞培養(yǎng)癌細(xì)胞B細(xì)胞1抗體1細(xì)胞培養(yǎng)癌細(xì)胞英國·米爾斯坦德國·科勒閱讀教材圖2-16，用箭頭和文字，畫出單克隆抗體制備過程。任務(wù)二：單克隆抗體及其應(yīng)用B淋巴細(xì)胞注射特定抗原骨髓瘤細(xì)胞融合多種雜交細(xì)胞篩選1多種雜交瘤細(xì)胞特定的雜交瘤細(xì)胞抗原-抗體檢測

篩選2增殖體外培養(yǎng)小鼠腹腔內(nèi)增殖單克隆抗體選擇性培養(yǎng)基單克隆抗體一個雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞群抗體克隆任務(wù)二：單克隆抗體及其應(yīng)用單克隆抗體的應(yīng)用（1）作為診斷試劑——最廣泛的應(yīng)用抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體在妊娠第8天，準(zhǔn)確率在90﹪以上。任務(wù)二：單克隆抗體及其應(yīng)用單克隆抗體的應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)：位置準(zhǔn)確、療效高、副作用?。?）用于運(yùn)載藥物和治療疾病細(xì)胞凋亡①ADC被細(xì)胞吞噬②⑤ADC抗體藥物接頭抗體-藥物偶聯(lián)物任務(wù)二：單克隆抗體及其應(yīng)用單克隆抗體的應(yīng)用抗體-藥物偶聯(lián)物

（ADC）細(xì)胞凋亡①ADC被細(xì)胞吞噬②⑤ADC抗體藥物接頭實(shí)現(xiàn)了對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷。1.ADC的抗體和藥物各具有什么作用？抗體主要發(fā)揮靶向運(yùn)輸作用，即通過特異性結(jié)合靶細(xì)胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細(xì)胞；藥物發(fā)揮治療效應(yīng)，如殺傷靶細(xì)胞。2.除了細(xì)胞毒素，還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？可以用放射性同位素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行靶向放療。一些作用于細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細(xì)胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結(jié)合進(jìn)行治療。3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應(yīng)用上各具有什么優(yōu)勢？單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原反應(yīng)，因此檢測的特異性和靈敏度大大提高；生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)、冷凍保存和復(fù)蘇利用，有利于控制產(chǎn)品的質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)診斷試劑盒。ADC能夠協(xié)同發(fā)揮抗體特異性識別的靶向作用和細(xì)胞毒素對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點(diǎn)清楚、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。課后習(xí)題“（悟空）拔一把毫毛，丟在口中嚼碎，望空噴去，叫一聲‘變！’即變作三二百個小猴，周圍攢簇?！比?、動物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動物1.動物細(xì)胞核移植技術(shù)：是指將動物一個細(xì)胞的細(xì)胞核移入去核的卵母細(xì)胞中，使這個重新組合的細(xì)胞發(fā)育成新胚胎，繼而發(fā)育成動物個體的技術(shù)。2.原理：動物細(xì)胞核的全能性三、動物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動物3.生殖方式：無性生殖4.種類：胚胎細(xì)胞核移植：體細(xì)胞核移植：細(xì)胞分化程度低，表現(xiàn)全能性容易細(xì)胞分化程度高，表現(xiàn)全能性十分困難三、動物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動物5.非人靈長類動物體細(xì)胞核移植的困難原因：（1）供體細(xì)胞的細(xì)胞核在去核卵母細(xì)胞中不能完全恢復(fù)其分化前的功能狀態(tài)，這導(dǎo)致了胚胎發(fā)育率低。（2）對非人靈長類動物胚胎進(jìn)行操作的技術(shù)尚不完善。任務(wù)一：體細(xì)胞核移植的過程自主學(xué)習(xí)：閱讀P53圖2-18，思考下列問題1.在將體細(xì)胞的核移植到卵母細(xì)胞之前，為什么必須先對卵母細(xì)胞進(jìn)行去核操作？2.你認(rèn)為用上述體細(xì)胞核移植技術(shù)培育的克隆動物，是對體細(xì)胞供體動物進(jìn)行了100%的復(fù)制嗎？為什么？3.體細(xì)胞核移植技術(shù)與誘導(dǎo)iPS細(xì)胞相比，有什么相似或不同之處？請你預(yù)測它們應(yīng)用前景的差異。任務(wù)一：體細(xì)胞核移植的過程1.在將體細(xì)胞的核移植到卵母細(xì)胞之前，為什么必須先對卵母細(xì)胞進(jìn)行去核操作？為了使核移植的胚胎或動物的核遺傳物質(zhì)全部來自有重要利用價值的動物提供的體細(xì)胞。任務(wù)一：體細(xì)胞核移植的過程2.你認(rèn)為用上述體細(xì)胞核移植技術(shù)培育的克隆動物，是對體細(xì)胞供體動物進(jìn)行了100%的復(fù)制嗎？為什么？不是對核供體動物進(jìn)行100%的復(fù)制。①克隆動物絕大部分DNA來自供體動物的細(xì)胞核，但細(xì)胞質(zhì)中的DNA（線粒體中的DNA）同時來自供體細(xì)胞和受體卵母細(xì)胞;②性狀是基因與環(huán)境共同作用的結(jié)果，克隆動物所處的環(huán)境與核供體細(xì)胞生活的環(huán)境不會完全相同；③克隆動物在個體發(fā)育過程中有可能發(fā)生基因突變、染色體變異等可遺傳變異；任務(wù)一：體細(xì)胞核移植的過程3.體細(xì)胞核移植技術(shù)與誘導(dǎo)iPS細(xì)胞相比，有什么相似或不同之處？請你預(yù)測它們應(yīng)用前景的差異。體細(xì)胞核移植技術(shù)誘導(dǎo)iPS細(xì)胞相同都能生成干細(xì)胞不同操作過程供體細(xì)胞核與去核卵母細(xì)胞融合將體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)到類似胚胎干細(xì)胞的狀態(tài)操作難度和體細(xì)胞的分化程度有關(guān)，過程復(fù)雜相對簡單任務(wù)二：體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景及存在的問題1.應(yīng)用前景：（1）畜牧生產(chǎn)：加速家畜遺傳改良進(jìn)程，促進(jìn)優(yōu)良畜群繁育。任務(wù)二：體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景及存在的問題1.應(yīng)用前景：（2）在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域：①通過建立轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞系，再利用體細(xì)胞核移植技術(shù)培育的轉(zhuǎn)基因克隆動物可以作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)許多珍貴的醫(yī)用蛋白；任務(wù)二：體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景及存在的問題1.應(yīng)用前景：（2）在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域：②在治療人類疾病時，轉(zhuǎn)基因克隆動物的細(xì)胞、組織或器官可以作為異