第一部分微生物學(xué)基本實驗技術(shù)第一次實驗（4學(xué)時，1人/組）顯微鏡技術(shù)緒言目的與規(guī)定：理解本學(xué)期《微生物學(xué)實驗》的基本內(nèi)容和實驗須知事項。講授：將本課程要開設(shè)的全部實驗分板塊進行簡樸介紹，讓學(xué)生有個基本理解；介紹微生物實驗室應(yīng)注意的某些問題（涉及生物安全、水電防火安全，實驗前要預(yù)習(xí)、實驗中要認(rèn)真、統(tǒng)計要完整、實事求是等）和慣用器皿。第一次實驗微生物的分離與接種（4學(xué)時，2人/組）實驗一單位培養(yǎng)基的配備與滅菌、無菌器材的準(zhǔn)備（P15-28）（3學(xué)時）一、實驗?zāi)康呐c規(guī)定1.學(xué)習(xí)掌握培養(yǎng)基的配制原理，能根據(jù)不同的培養(yǎng)對象選用對應(yīng)的培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件。2.通過對牛肉膏蛋白胨細(xì)菌培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的普通辦法和環(huán)節(jié)。3.理解慣用滅菌辦法的原理及其應(yīng)用范疇。4.學(xué)習(xí)掌握高壓蒸汽滅菌的原理和操作技術(shù)。掌握無菌操作技術(shù)。5．純熟準(zhǔn)備無菌器材，為微生物的分離和純化做好準(zhǔn)備工作。二、實驗器材溶液和試劑牛肉膏、蛋白胨，氯化鈉，瓊脂，1mol/LNaOH等。2.儀器和其它用品試管，三角瓶，燒杯，量筒，培養(yǎng)皿、玻棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，藥勺，高壓蒸汽滅菌鍋，pH試紙等。三、基本原理牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌天然培養(yǎng)基，有時又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有普通細(xì)菌生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質(zhì)，因此可供作微生物生長繁殖之用。牛肉膏為微生物生長提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨提供氮源和維生素，氯化鈉提供無機鹽。瓊脂是固化劑。配方：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，水1000ml，用稀酸或稀堿將pH值調(diào)到pH7.4-7.6。固體培養(yǎng)基普通加瓊脂20g。高壓蒸汽滅菌是將將待滅菌的物品放在一種密閉的加壓容器內(nèi)，通過加熱使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。這種水蒸氣能將鍋內(nèi)冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后在關(guān)閉排氣閥的狀況下繼續(xù)加熱，鍋內(nèi)蒸汽能增加鍋內(nèi)的壓力，使沸點提高，得到高于100℃四、講授重點1．培養(yǎng)基種類和配制培養(yǎng)基的基本原理。2．高壓蒸汽滅菌的原理和規(guī)范操作流程。五、實驗操作環(huán)節(jié)1．牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的制備（每組200ml）稱量-溶化-調(diào)pH–定溶-分裝-加塞-包扎-滅菌-擱置斜面或倒平板-無菌檢查稱量：按培養(yǎng)基配方比例依次稱取牛肉膏0.6g、蛋白胨2g、氯化鈉1g放入燒杯中。瓊脂4g備用。溶化：量取200ml蒸餾水，加入少量至上述燒杯中，用玻璃棒攪拌，待藥品溶解后，加入瓊脂，倒入余下的水，在電熱板上加熱熔化調(diào)pH：待培養(yǎng)基稍冷卻后，用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH，若偏酸，用1mol/LNaOH邊滴加邊攪拌，使之達成pH7.4-7.6。若偏堿，則用1mol/LHCL調(diào)節(jié)。定溶：用量筒定溶到200ml。分裝：用分裝裝置將培養(yǎng)基裝入試管，高度為試管總長的1/5，每組6管。余下培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入三角瓶中，培養(yǎng)基的量為三角瓶容量的1/3-1/2。加塞：試管加棉花塞或泡沫塑料塞，三角瓶加蓋棉塞或8層紗布。包扎：6支試管扎成一捆，棉塞外加一層牛皮紙或雙層報紙防滅菌時冷凝水濕潤棉塞，在外用麻繩扎成活結(jié)。三角瓶棉塞或紗布外加蓋牛皮紙或雙層報紙，用麻繩扎成活結(jié)。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。滅菌：見實驗流程3擱置斜面：待滅菌的試管培養(yǎng)基冷卻至50℃無菌檢查：滅菌培養(yǎng)基放入37℃2．牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的制備（1000ml/班）稱取牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，倒入燒杯中，量取蒸餾水1000ml，先用少量水溶解藥品，后加入余下的水，用稀酸或稀堿將pH值調(diào)到pH7.4-7.6。用分裝裝置將培養(yǎng)液分裝到試管中，高度為試管長度的1/4。每組6管，自行分裝、包扎、滅菌。3．準(zhǔn)備無菌器材每組用報紙將8個培養(yǎng)皿包成一包，用報紙包1ml移液管5支、10ml移液管2支、玻璃涂布棒1根。每組捆扎加塞試管5支，每組用100ml三角燒瓶裝入不超出三角瓶容積1/2的去離子水，加棉塞后，外加一層牛皮紙或雙層報紙，麻繩扎成活結(jié)，用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別。3．高壓蒸汽滅菌取出內(nèi)層鍋，向外層鍋內(nèi)注入適量的水，使水面與三角擱架相平；將用防水紙包扎好的物品放入滅菌器內(nèi)層鍋里，內(nèi)層鍋放回原位；加蓋，并經(jīng)兩兩對稱方式同時旋緊相對的兩個螺栓；接通電源，進行加熱，全自動高壓鍋應(yīng)關(guān)閉排氣閥，手提式高壓鍋應(yīng)打開排氣閥，待排完冷空氣后再關(guān)上排氣閥。0.1MPa，121℃，維持20min；六、實驗過程中的注意事項1.培養(yǎng)基的配制加熱熔化過程中，要不停攪拌，以免瓊脂或其它固體物質(zhì)粘在燒杯底上燒焦。加熱過程中所蒸發(fā)的水分應(yīng)補足；pH值必須按不同培養(yǎng)基規(guī)定精確測定；全部器皿要清潔，忌用鋼質(zhì)、鐵質(zhì)器皿；分裝培養(yǎng)基時，注意不使培養(yǎng)基沾在瓶口或管壁上端以免浸濕棉塞，引發(fā)雜菌污染；培養(yǎng)基滅菌的時間和溫度，需按照多個培養(yǎng)基的規(guī)定進行，以達成滅菌效果且不損害必要營養(yǎng)成分；滅菌后的培養(yǎng)基須放37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，無細(xì)菌生長時方可使用。2.消毒和滅菌使用滅菌鍋應(yīng)嚴(yán)格按照操作程序進行，避免發(fā)生事故，如鍋內(nèi)應(yīng)加足水份，以防干燒；滅菌時，操作者切勿私自離開；務(wù)必待壓力下降到零后，才可打開鍋蓋；干熱滅菌時電烘箱中物品不要擺得太擁擠，以免妨礙空氣流通而影響滅菌效果；滅菌物品不要與電烘箱內(nèi)壁的鐵板接觸，以防包裝紙烤焦起火。七、思考題1．固體培養(yǎng)基加瓊脂后加熱溶化時要注意哪些問題？培養(yǎng)基中加瓊脂的作用是什么？2．培養(yǎng)基配好后，為什么必須立刻滅菌？如何檢查培養(yǎng)基滅菌與否徹底？3．高壓蒸汽滅菌開始前，為什么要將鍋內(nèi)冷空氣排盡？滅菌完畢后，為什么待壓力降至0時才干打開排氣閥，開蓋取物？八、實驗操作考核點操作與否規(guī)范實驗二微生物的分離與接種及無菌操作技術(shù)一、實驗?zāi)康呐c規(guī)定1.體會無菌操作技術(shù)在微生物研究中的重要性。2.掌握倒平板的辦法，掌握慣用微生物轉(zhuǎn)接的無菌操作技術(shù)。3．理解幾個慣用的微生物接種辦法，用稀釋涂布法或平板劃線法進行微生物分離時，能獲得單菌落。二、實驗器材1．菌種：大腸桿菌（Escherichiacoli）培養(yǎng)平板或斜面培養(yǎng)物培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨固體和液體培養(yǎng)基。3.儀器和其它用品接種環(huán)、酒精燈、試管架、記號筆、培養(yǎng)皿、恒溫培養(yǎng)箱等。三、基本原理高溫對微生物含有致死效應(yīng)，在微生物接種時，普通在酒精燈旁進行，用火焰直接灼燒接種環(huán)，以達成滅菌的目的。自然界中多個微生物混雜生活在一起，即使取極少量的樣品也是許多微生物共存的群體，要研究某種微生物的特性，首先須使該微生物處在純培養(yǎng)狀態(tài)。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。平板分離法慣用的有：稀釋涂布平板法、稀釋混合平板法與平板劃線法。不同的微生物在固體、半固體和液體培養(yǎng)基中能體現(xiàn)出各自特有的培養(yǎng)特性，這些特性能夠作為不同種類微生物的鑒別特性之一。四、講授重點1．倒平板2．微生物轉(zhuǎn)接辦法3．平板劃線法和涂布平板法五、實驗操作環(huán)節(jié)1．試管斜面和液體培養(yǎng)基接種技術(shù)（無菌操作技術(shù)）A、試管斜面接種法（用接種環(huán)轉(zhuǎn)接菌種）：標(biāo)記–取菌–接種–培養(yǎng)標(biāo)記：用記號筆看待接試管斜面培養(yǎng)基進行標(biāo)記，寫上待接菌種名稱、接種日期、組別。取菌：左手拿大腸桿菌試管斜面培養(yǎng)物，右手持接種環(huán)，將接種環(huán)在火焰上進行灼燒滅菌，然后在火焰旁用右手小指指和無名指或右手掌緣拔出并夾住試管棉塞，試管口在火焰上燒一下。接種環(huán)輕輕插入斜面上半部，在管壁冷卻水上或管壁上使接種環(huán)冷后，挑起少量菌苔，再燒一下試管口，塞上棉塞，左手把斜面試管放回試管架。右手持有菌接種環(huán)在酒精燈旁無菌區(qū)。接種：左手從試管架上取出標(biāo)記好的斜面試管一支，右手掌緣拔出棉塞，試管口在酒精燈上灼燒一下，沾有菌苔的接種環(huán)快速放進斜面底部，從下到上劃始終線，然后再從底部開始向上作蛇形劃線接種。完畢后，燒一下試管口，塞上棉塞，接種環(huán)在火焰上灼燒后放回原處。培養(yǎng)：試管放37℃B．液體培養(yǎng)基接種法：接種流程同A。接種時略有不同，即將挑有菌苔的接種環(huán)在液體表面的管內(nèi)壁上輕輕摩擦，使菌體分散從環(huán)上脫開，進入液體培養(yǎng)基中。輕輕搖勻培養(yǎng)液。2．平板分離技術(shù)A．稀釋涂布平板法：倒平板–菌液稀釋–涂布–培養(yǎng)–挑單菌落倒平板：滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基冷卻到55℃左右，搖勻。解開麻繩，去掉三角瓶口上的牛皮紙和紗布，右手持裝培養(yǎng)基的三角瓶在酒燈旁，瓶口對著火焰。左手持9cm菌液稀釋：取5支無菌試管，每管加9ml無菌水，無菌操作取1ml大腸桿菌菌液至9ml無菌水中混勻，依次進行10倍稀釋。涂布：取0.1ml稀釋菌液入平板中，用無菌涂布棒在培養(yǎng)基表面涂布均勻。培養(yǎng)：合上皿蓋，倒置培養(yǎng)皿于37℃挑菌落：挑取單個菌落的菌苔少量，涂在載玻片上進行顯微鏡個體形態(tài)觀察，結(jié)合菌落形態(tài)特性綜合分析。若不純，需再用平板分離法進行純化。B．平板劃線法：倒平板–劃線–培養(yǎng)–挑單菌落。倒平板、培養(yǎng)和挑單菌落同A。劃線：左手拿平板，右手拿接種環(huán)在火焰上滅菌后沾取菌液或菌苔一環(huán)，在平板上劃平行線三條，接種環(huán)在火焰上滅菌，左手轉(zhuǎn)動平皿約70度，用無菌接種環(huán)通過第一次劃線的末端作為起點作二次劃線，依次作第三次、第四次劃線（平行線劃線法）?；?qū)⑻羧∮芯慕臃N環(huán)在平板培養(yǎng)基上作持續(xù)劃線。六、實驗過程中的注意事項1．無菌接種技術(shù)無菌操作需在火焰旁進行，手不可觸摸試管口端，以防燙傷；接種時接種環(huán)不要碰觸試管口邊，避免污染；棉塞不可放在桌面上，應(yīng)當(dāng)用右手手緣或右手指間夾住。2．平板分離技術(shù)倒平板時，培養(yǎng)皿邊沿不要沾染培養(yǎng)基，搖勻培養(yǎng)基時要輕，以防培養(yǎng)液濺到皿蓋或溢出培養(yǎng)皿；劃線接種時，動作要輕，注意不要劃破培養(yǎng)基；分離、接種時應(yīng)嚴(yán)格按無菌操作規(guī)定進行；平板培養(yǎng)微生物時一定要倒置培養(yǎng)。七、實驗成果1．統(tǒng)計液體培養(yǎng)基和固體斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌的生長狀況。2．統(tǒng)計菌種分離培養(yǎng)的成果。八、實驗操作考核點1．無菌操作2．平板劃線辦法與否對的第二次實驗（4學(xué)時，1人/組）實驗三普通光學(xué)顯微鏡的使用及微生物形態(tài)觀察（P40-47）一、實驗?zāi)康暮鸵?guī)定1．理解普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造及各部分的功效。2．學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和使用辦法、維護的基本知識。3．掌握運用顯微鏡觀察不同微生物的基本技能。4．理解細(xì)菌、放線菌、酵母、霉菌在顯微鏡下的基本形態(tài)特性。二、實驗器材菌種：細(xì)菌、放線菌、酵母和霉菌的染色玻片標(biāo)本（每種最少一片/組）。溶液和試劑：香柏油、乙醇乙醚混合液或二甲苯等（各一瓶/組）。儀器或其它用品：普通光學(xué)顯微鏡（1臺/組）、擦鏡紙。三、基本原理當(dāng)代普通光學(xué)顯微鏡運用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來放大成像，故又常被稱為復(fù)式顯微鏡。它們由機械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分構(gòu)成，在顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中，物鏡的性能最為核心，它直接影響著顯微鏡的分辨率，而在普通光學(xué)顯微鏡普通配制的幾個物鏡中，油鏡的放大倍數(shù)最高，但需要在載波片與鏡頭之間加滴鏡油，重要是為了增加照明亮度和提高顯微鏡的分辨率。物鏡放大倍數(shù)越大，焦距越短，直徑更小，所需光強越大。從承載標(biāo)本的玻片透過來的光線，因介質(zhì)密度不同，會發(fā)生折射或全反射使光線不能進入鏡頭。成果造成物像不清。在油鏡和玻片間滴加與玻璃折射率（空氣是1.55，香柏油是1.52）相近的鏡油，使光線不會造成太大的損失。顯微鏡分辯率是顯微鏡能分辨兩點之間的最小距離的能力，最小距離越小，分辨率越高。分辯率=λ/2NA=λ/2n·sin（α/2）公式中λ可見光波長，平均為0.55μm，n折射率(香柏油1.52，空氣1.0，水1.33)，NA是物鏡的數(shù)值孔徑，取決于物鏡的鏡口角和玻片與鏡頭間介質(zhì)的折射率。四、講授重點1.顯微鏡構(gòu)造2.油鏡工作原理3．如何使用雙目清晰觀察物像4．聚光器數(shù)值孔徑的調(diào)節(jié)5．運用物鏡的同焦現(xiàn)象，如何配合使用低倍鏡、高倍鏡和油鏡分別在不同物鏡下獲得清晰圖像。6．?dāng)?shù)碼顯微鏡拍照軟件的使用五、實驗操作環(huán)節(jié)（一）顯微鏡操作觀察前準(zhǔn)備：鏡座距實驗臺邊沿約10cm，光源調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)目鏡、調(diào)節(jié)聚光器數(shù)值孔徑值。顯微鏡觀察：一種辦法是先低倍再高倍再油鏡，使用微調(diào)節(jié)器聚焦。第二種辦法是在低倍下找到樣品區(qū)，用粗調(diào)節(jié)器升高鏡筒，將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置，在樣品區(qū)滴加鏡油后，從側(cè)面注視用粗調(diào)節(jié)器小心降下鏡筒，并使油鏡浸在鏡油中并幾乎與標(biāo)本相接，調(diào)節(jié)聚光器的數(shù)值孔徑及視野照明亮度后，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒漸漸上升，再用細(xì)調(diào)節(jié)器使聚焦清晰為止。后一種辦法盡量不用，在實驗中重點介紹和使用第一種辦法。顯微鏡用畢后的解決：上升鏡筒，取下載玻片；擦凈鏡油；清潔物鏡及目鏡；還原各部件，降下聚光鏡。（二）數(shù)碼顯微鏡軟件Motic六、實驗過程中的注意事項1．顯微鏡是精密儀器，在取放時要一手托住底座，一手握住鏡臂，忌用單手拎提。2．養(yǎng)成雙目觀察的習(xí)慣，忌單眼觀察。3．觀察時可摘下近視鏡或遠(yuǎn)視鏡，因顯微鏡含有聚焦校正功效。若在觀察時配載眼鏡，應(yīng)避免眼鏡鏡片與目鏡鏡片接觸，以免造成鏡片劃痕。4．顯微鏡照明亮度的調(diào)節(jié)，可通過升降聚光器或變化光源亮度進行調(diào)節(jié)，普通狀況下聚光器都是調(diào)到最高位置。只要能獲得良好的觀察效果，也能夠通過對虹彩光圈、聚光器高度、照明光源強度的協(xié)同調(diào)節(jié)靈活運用。5．使用粗節(jié)器聚焦物像時，必須養(yǎng)成的習(xí)慣是：先從側(cè)面注視并小心調(diào)節(jié)物鏡靠近標(biāo)本，然后用目鏡觀察，慢慢調(diào)節(jié)物鏡離開標(biāo)本。否則可能因誤操作而損壞鏡頭及玻片。6．普通狀況下，可運用同焦現(xiàn)象，對在低倍鏡下看到的物像，能夠轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器將其它物鏡轉(zhuǎn)到工作位置，然后用細(xì)調(diào)節(jié)器對物像進行清晰聚焦，能夠避免因使用粗調(diào)節(jié)器時可能發(fā)生的誤操作而損害鏡頭或玻片。7．使用乙醇乙醚混和物或二甲笨等清潔劑時，不要過量使用或讓其在鏡頭上停留時間過長，因清潔劑對鏡頭會造成損害。不能用手或濾紙擦鏡頭，以免污染鏡頭或產(chǎn)生劃痕。8．注意分辨待觀察樣品與使用時間較長的顯微鏡鏡頭上的霉點等污物。9．每人在D盤上建一種文獻夾，以班級加名字作文獻夾名，將圖片放在其中。每個圖片文獻采用JPEG格式，以學(xué)生名字、菌種屬名和總放大倍數(shù)作為文獻名。七、實驗成果用數(shù)碼顯微鏡軟件分別拍攝你在低倍或高倍物鏡下所觀察到的放線菌、酵母菌和真菌的形態(tài)圖及在油鏡下所觀察到的細(xì)菌形態(tài)圖，制成圖版打印黑白圖片，并標(biāo)注菌種名稱、觀察物鏡及總放大倍數(shù)。注意：每人需在低倍或高倍物鏡下觀察放線菌、酵母和霉菌，在油鏡下觀察細(xì)菌，每一類型的微生物最少觀察一種標(biāo)本片。八、思考題1．用油鏡觀察時應(yīng)注意哪些問題？2．在載玻片和鏡頭之間滴加香柏油有什么作用？九、本實驗的實驗操作考核點油鏡下的物像清晰度實驗四細(xì)菌制片與簡樸染色法（P69-84）一、實驗?zāi)康暮鸵?guī)定1.學(xué)習(xí)并掌握細(xì)菌涂片、簡樸染色的基本技術(shù)。2．初步理解無菌操作技術(shù)，鞏固顯微鏡(油鏡)操作辦法。二、實驗器材1．菌種：大腸桿菌（Escherichiacoli），枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），金黃色葡萄球菌（Saphylococcusaureus）斜面培養(yǎng)物。2.染色劑：堿性美藍染液，石炭酸復(fù)紅染液。3.儀器或其它用品：顯微鏡，酒精燈，載玻片，鑷子、接種環(huán)、載玻片夾子、濾紙等。三、基本原理細(xì)菌制片常采用涂片法，通過涂沫能使細(xì)菌細(xì)胞個體均勻分散在載玻片上，有助于觀察個體形態(tài)。加熱固定使細(xì)胞質(zhì)凝固，使細(xì)胞固定在載玻片上，能殺死大多數(shù)細(xì)菌但不會破壞細(xì)胞形態(tài)。微生物染色的基本原理是借助物理和化學(xué)因素的作用而進行的。物理因素：細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲入和吸附作用等?；瘜W(xué)因素：重要是正負(fù)離子之間的互相吸引。染色劑按染料電離后所在地帶電荷的性質(zhì)分為幾個類型：酸性染料（如酸性復(fù)紅，剛果紅，伊紅和苯胺黑等）、堿性染料（堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠、番紅、結(jié)晶紫、美蘭等，細(xì)菌易被這種染料染色）、中性（復(fù)合）染性（伊紅，美蘭，Gimsa染料）。簡樸染色法是運用單一染料（如呂氏美藍、堿性品紅）對細(xì)菌進行染色的一種辦法，合用于菌體普通形狀和細(xì)菌排列的觀察。在中性、堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞普通帶負(fù)電荷，堿性染料電離時的染色部分帶正電荷，因此，堿性染料的染色部分容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色。在顯微鏡下因與背景有明顯對比而易于識別。四、講授重點1.細(xì)菌簡樸染色的原理。2.無菌操作與細(xì)菌涂片操作要點。3.染色劑的類型與慣用種類。4．顯微鏡的的使用。五、實驗操作環(huán)節(jié)涂片-干燥-固定–染色–水洗–干燥-鏡檢1．涂片：取干凈載玻片，用記號筆做好標(biāo)記，滴一滴生理鹽水于載玻片中央；用接種環(huán)無菌操作分別挑取適量菌苔，沾有菌苔的接種環(huán)在載玻片上的生理鹽水中涂抹，使菌懸液在載玻片上形成均勻薄膜（如果用液體培養(yǎng)物，則用接種環(huán)蘸取1-2環(huán)菌液直接涂沫于載玻片上）。2．干燥：自然風(fēng)干或用電吹風(fēng)干燥。3．固定：細(xì)菌涂面朝上，通過火焰2-3次。4．染色：載玻片平放于桌面或載玻片支架上，滴加染液使之覆蓋菌膜，普通染色1-2分鐘。5．水洗：傾去染液，用自來水沖洗，水流宜緩，否則易沖掉細(xì)菌涂膜，至洗出的水無色為止。6．干燥：用吸水紙吸去多出水分，自然風(fēng)干。7．鏡檢：制好的樣片在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計。六、注意事項1．涂片時取菌量要適量，且規(guī)定涂布均勻。2．無菌操作取菌時一定要等接種環(huán)冷卻后再取菌，以免高溫使菌體變形。3．涂片需干燥后再加熱固定，避免加熱時間過長引發(fā)細(xì)胞易破裂或變形，以至載玻片破裂。加熱固定時要用載玻片夾子或鑷子，以免燙傷。4．使用染料時注意避免沾到衣物和實驗臺面上。七、實驗成果拍攝在油鏡下觀察到的細(xì)菌形態(tài)圖，標(biāo)明菌種名稱和總放大倍數(shù)。注意：每人最少用一種染色劑對一種菌種進行染色、觀察和統(tǒng)計實驗成果。八、思考題在進行細(xì)菌涂片時應(yīng)注意哪些環(huán)節(jié)？為什么規(guī)定制片完全干燥后才干用油鏡觀察？九、實驗操作考核點1．涂片質(zhì)量2．油鏡下圖像的清晰度實驗五細(xì)菌革蘭氏染色法一、實驗?zāi)康暮鸵?guī)定1.理解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。2．掌握革蘭氏染色法操作技術(shù)。二、實驗器材菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），大腸桿菌（Escherichiacoli），金黃色葡萄球菌（Saphylococcusaureus）等細(xì)菌斜面培養(yǎng)物。2.染色劑：石炭酸復(fù)紅染液，草酸銨結(jié)晶紫染液，盧戈氏碘液，95%乙醇。3.儀器或其它用品：顯微鏡，酒精燈，載玻片，鑷子、接種環(huán)、載玻片夾子、濾紙等。三、基本原理革蘭氏染色法將細(xì)菌分為革蘭氏陽性和陰性，是由這兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的構(gòu)造和構(gòu)成不同決定的，當(dāng)用脫色劑解決時，兩類細(xì)菌的脫色效果是不同的，革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁重要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀構(gòu)造構(gòu)成，壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇（或丙酮）脫色時細(xì)胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀構(gòu)造孔徑縮小，通透性減少，從而使結(jié)晶紫－碘復(fù)合物不易被洗脫而保存在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保存初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高，因此當(dāng)脫色解決時，類脂質(zhì)被乙醇溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫－碘的復(fù)合物比較容易洗脫出來，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。革蘭氏染色是細(xì)菌分類的重要根據(jù)之一。四、講授重點1.細(xì)菌革蘭氏染色的原理。2.革蘭氏染色操作要點和成果判斷。五、實驗操作環(huán)節(jié)制片-初染-媒染-脫色-復(fù)染-鏡檢-混合涂片染色1．制片：與細(xì)菌簡樸染色法的涂片、干燥和固定過程相似。2．初染：滴加結(jié)晶紫染色液于菌膜上1-2分鐘，流水沖洗。3．媒染：盧戈氏碘液沖洗一下菌膜，再滴加該液于菌膜上，靜置1分鐘。4．脫色：95%酒精沖洗至無色后，再水洗。5．復(fù)染：番紅染色液覆蓋菌膜，靜置2分鐘后水洗，干燥。6．鏡檢：顯微鏡觀察。7．混合涂片染色：在熟悉上述革蘭氏染色過程后，在同一載玻片上用枯草芽孢桿菌與大腸桿菌或大腸桿菌與與金黃色葡萄球菌作混合涂片，染色、鏡檢比較觀察。六、實驗注意事項1．實驗二中的注意事項同樣合用于本實驗。2．選用活躍生長久菌種、涂片厚度適宜、脫色程度適宜，能避免產(chǎn)生假性革蘭氏染色成果。七、實驗成果1．拍攝油鏡下觀察到的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌或枯草芽孢桿菌與大腸桿菌的單菌涂片及混合涂片的革蘭氏染色菌體圖。2．將實驗成果填于表2-1。表2-1革蘭氏染色成果統(tǒng)計表菌名菌體顏色細(xì)菌形態(tài)成果（G+、G-）八．思考題1．在進行細(xì)菌涂片時應(yīng)注意哪些環(huán)節(jié)？為什么規(guī)定制片完全干燥后才干用油鏡觀察？2．革蘭氏染色能否成功，有哪些問題需要注意，為什么？你認(rèn)為革蘭氏染色法中哪個環(huán)節(jié)能夠省略？在何種狀況下能夠省略？九、本實驗操作部分考核點1．無菌操作2．染色過程操作與否規(guī)范3．顯微鏡操作實驗六細(xì)菌芽胞染色法一、實驗?zāi)康暮鸵?guī)定1.學(xué)習(xí)并掌握芽孢染色法的原理和技術(shù)，理解芽孢的形態(tài)特性。2.鞏固顯微鏡(油鏡)操作辦法。實驗器材1.菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）斜面培養(yǎng)物。2.染色劑：石炭酸復(fù)紅染液，5%孔雀綠水溶液。3.儀器或其它用品：顯微鏡，酒精燈，載玻片，鑷子、接種環(huán)、載玻片夾子、濾紙等。三、基本原理芽孢是某些細(xì)菌生長到一定階段在菌體內(nèi)形成的休眠體，普通是圓形或橢圓形。細(xì)菌能否形成芽孢及芽孢的形狀、在芽孢囊內(nèi)的位置、芽孢囊與否膨大等特性是鑒定細(xì)菌的根據(jù)之一。因芽孢壁厚、透性低、不易著色，但一旦著色也很難脫去。當(dāng)用著色力強的染色劑（如孔雀綠、石炭酸復(fù)紅）在加熱條件下染色時，染料可進入菌體和芽孢內(nèi)，但菌體內(nèi)的染料經(jīng)水洗可脫掉，芽孢內(nèi)的染料仍然存在呈色。用對比度大的復(fù)染劑染色時，芽孢保存初染劑的顏色，菌體和芽孢囊呈現(xiàn)復(fù)染劑的顏色。四、講授重點1.芽孢染色原理和Schaeffer-Fulton氏染色辦法。2.細(xì)菌芽孢的形態(tài)。五、實驗操作環(huán)節(jié)Schaeffer-Fulton氏染色法：1．制片：涂片、干燥、固定。2．染色：5%孔雀綠滴在涂片上，夾子夾住玻片一端，在微火上加熱至染料冒蒸氣開始計時5分鐘。3．水洗：待玻片冷卻后用流水沖洗至流出的水為無色。4．復(fù)染：番紅染液復(fù)染2分鐘，水洗，干燥。5．鏡檢六、實驗注意事項1．實驗二的注意事項合用于本實驗。2．選用適宜菌齡的菌種進行芽孢染色，幼齡菌尚未產(chǎn)生芽孢，老齡菌芽孢囊已破裂，不易獲得對的染色成果。3．加熱時間和溫度要適宜，否則芽胞不易著色或溫度過高造成菌體或芽孢囊破裂。4．在將孔雀石綠染液加熱時切不可蒸干。5．脫色時必須等玻璃片冷卻后再進行，否則冷水沖洗易造成玻片破裂。6．注意安全，謹(jǐn)防燙傷和使用酒精燈時可能引發(fā)的火災(zāi)。七、實驗成果繪圖并闡明枯草芽孢桿菌的形態(tài)特性。八、思考題為什么芽孢染色需要進行加熱？能否用簡樸染色法觀察到細(xì)菌芽孢？九、實驗操作考核要點1．染色成果與否對的2．涂片質(zhì)量3．顯微鏡操作第三次實驗微生物個體形態(tài)和群體形態(tài)觀察（P69-76）（4學(xué)時，1人/組）實驗六放線菌個體形態(tài)和菌落形態(tài)觀察一、實驗?zāi)康暮鸵?guī)定1.學(xué)習(xí)并掌握放線菌幾個制片辦法和簡樸染色的基本技術(shù)。2.掌握放線菌個體細(xì)胞和菌落的形態(tài)特性，并注意與霉菌、酵母菌的互相區(qū)別。二、實驗器材1．菌種：放線鏈霉菌（Streptomycessp.)插片平板培養(yǎng)物。2．染色劑：呂氏堿性美藍染液，石炭酸復(fù)紅染色液。3．儀器和其它用品：顯微鏡、酒精燈、載玻片、蓋玻片、濾紙片、接種環(huán)、接種鏟、鑷子等。三、基本原理放線菌是指能形成分枝絲狀體或菌絲體的一類革蘭氏陽性細(xì)菌，常見放線菌大多能形成菌絲體。緊貼培養(yǎng)基表面或進一步培養(yǎng)基生長的叫營養(yǎng)菌絲（基內(nèi)菌絲，較透明較細(xì)），其生長到一定階段能向空氣中生長，叫氣生菌絲（較粗，色較暗），由氣生菌絲分化形成孢子絲及孢子。孢子絲成螺旋形、波浪形或分枝狀等，孢子常呈圓形、橢圓形或桿形。氣生菌絲、孢子絲和孢子的形態(tài)、顏色常作為放線菌分類的重要根據(jù)。制片時普通采用插片法并結(jié)合簡樸染色進行觀察，也能夠用印片法將放線菌菌落或菌苔表面的孢子絲印在載玻片上，經(jīng)簡樸染色后觀察。放線菌菌落干燥、不透明、表面呈致密的絲絨狀，上有一薄層“干粉”。酵母菌是一類呈單細(xì)胞生長的真核微生物的總稱，少數(shù)能形成假菌絲。酵母菌的菌落較濕潤，與細(xì)菌菌落較相似，但不透明。四、講授重點1．放線菌個體和菌落的普通形態(tài)特性。2．插片法觀察放線菌個體形態(tài)的辦法和操作要點。五、實驗操作環(huán)節(jié)（一）插片染色法1．取蓋片：取出放線鏈霉菌插片平板培養(yǎng)物，用鑷子輕取蓋片，擦去背面培養(yǎng)物。2．固定：用酒精燈微熱固定。3．染色：用堿性美藍染液或石炭酸復(fù)紅染色液染色1-2分鐘。4．水洗、干燥5．觀察：菌面朝上置于載片上，鏡檢觀察。（二）菌落形態(tài)觀察對放線菌瓊脂平板上的菌落進行認(rèn)真觀察，統(tǒng)計菌落大小、形狀、透明程度、顏色、表面干燥或濕潤，能否易挑取等特性。六、實驗過程中的注意事項1．放線菌插片法操作過程中，在移動附著有菌體的蓋玻片時勿碰動菌絲體，菌面需朝上，以免破壞菌絲體的形態(tài)。2．印片過程中，用力要輕，兩塊載玻片不能錯動。3．水洗時水流要緩，以免破壞孢子絲的形態(tài)。4．插片法觀察個體形態(tài)時，宜用微調(diào)節(jié)器分別聚焦，方便清晰觀察到處在不同焦平面上的孢子、孢子絲、氣生菌絲和基內(nèi)菌絲。5．觀察菌落時，注意正反兩面的顏色和菌落表面的薄層“干粉”，認(rèn)真分辨與霉菌菌落的異同點。不要隨意移動開蓋，以免孢子飛散污染實驗室。七、實驗成果繪圖并闡明所觀察到的放線菌的形態(tài)特性。八、思考題鏡檢時如何分辨基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲？九、實驗操作考核點1．能否分辨放線菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲、孢子絲和孢子。實驗七酵母菌個體形態(tài)、菌落形態(tài)觀察及死活細(xì)胞鑒定一、實驗?zāi)康暮鸵?guī)定1.學(xué)習(xí)并掌握酵母菌死活細(xì)胞鑒定的原理和基本操作技術(shù)。2.理解酵母菌的個體和菌落形態(tài)特性，及其與細(xì)菌的區(qū)別。二、實驗器材1．菌種：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）的平板培養(yǎng)物。（提供空氣中細(xì)菌培養(yǎng)平板，用于酵母和細(xì)菌菌落形態(tài)的比較觀察）。2．染色劑：呂氏堿性美藍染液，石炭酸復(fù)紅。3．儀器和其它用品：顯微鏡、酒精燈、載玻片、蓋玻片、濾紙片、接種環(huán)、鑷子等。三、基本原理酵母菌是不運動的單細(xì)胞真核微生物，少數(shù)能形成假菌絲，普通比常見細(xì)菌大幾倍甚至十幾倍。大多數(shù)酵母菌以出芽方式進行無性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通過接合產(chǎn)生子囊孢子。用美藍對酵母的活細(xì)胞進行染色時，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)含有較強的還原能力，能使美藍由藍色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型，故含有還原能力的酵母活細(xì)胞是無色的、而死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞則呈藍色或淡藍色。酵母菌的菌落較濕潤，與細(xì)菌菌落較相似，但不透明，有特殊的酒香味。四、講授重點1．酵母死活細(xì)胞鑒定原理。2．酵母細(xì)胞的個體形態(tài)，注意出芽繁殖方式是其重要特點。3．如何分辨酵母與細(xì)菌菌落。五、操作環(huán)節(jié)1．酵母個體形態(tài)及死活細(xì)胞觀察在載玻片上滴加1小滴生理鹽水，用接種環(huán)挑取少量菌苔，涂布均勻-在載玻片中央滴加1小滴呂氏堿性美藍染色液（0.1%）混合均勻-蓋上蓋玻片-放置3分鐘-先低倍后高倍鏡下觀察酵母形態(tài)和出芽狀況-30分鐘后再觀察。并根據(jù)顏色來區(qū)別死活細(xì)胞，藍色細(xì)胞是死細(xì)胞，無色細(xì)胞是活細(xì)胞。2．菌落形態(tài)觀察：認(rèn)真觀察酵母菌菌落，統(tǒng)計菌落大小、形狀、透明程度、顏色、表面干燥或濕潤，能否易挑取等特性，注意與細(xì)菌菌落的區(qū)別。六、實驗過程中的注意事項1．酵母菌制片時，當(dāng)菌體與染液混合時注意不要激烈涂沫，以免破壞細(xì)胞。2．生理鹽水和染液滴加量均要適中，蓋蓋玻片時，染液過多易溢出，過少易產(chǎn)憤怒泡。蓋玻片緩慢傾斜覆蓋，能避免產(chǎn)憤怒泡。3．觀察菌落特點時，注意其表面與否濕潤、大小和形態(tài)，注意與細(xì)菌菌落的區(qū)別。七、實驗成果1．繪圖闡明顯微鏡下所觀察到的酵母菌的形態(tài)特性。2．根據(jù)你所觀察到的呂氏美藍染液作用時間與釀酒酵母死、活細(xì)胞數(shù)量變化的狀況，填寫表3-1。表3-1酵母染色成果統(tǒng)計表呂氏美藍濃度0.1%作用時間3min30min每視野活細(xì)胞數(shù)（個）每視野活細(xì)胞數(shù)（個）八、思考題釀酒酵母通過出芽方式進行無性繁殖，也能形成子囊孢子進行有性繁殖，你在這實驗過程中與否觀察到釀酒酵母的子囊孢子？如果沒有，請分析因素。九、實驗操作考核點1．無菌操作2．制片3．顯微鏡操作實驗八霉菌的個體形態(tài)和菌落形態(tài)觀察一、實驗?zāi)康暮鸵?guī)定1.學(xué)習(xí)并掌握霉菌直接制片制片技術(shù)。2.理解四類常見霉菌（青霉、曲霉、毛霉、根霉）形態(tài)特性和互相區(qū)別。3.理解霉菌菌落形態(tài)特性及其與放線菌、酵母菌和細(xì)菌菌落的互相區(qū)別。二、實驗器材1．菌種：青霉（Penicilliunsp.）、曲霉(Aspergillusniger)、根霉(Rhizopussp.)的平板培養(yǎng)物。2．染色劑：呂氏堿性美藍染液或石炭酸復(fù)紅染色液。3．儀器和其它用品：顯微鏡、酒精燈、載玻片、蓋玻片、濾紙片紙、解剖針、鑷子、生理鹽水等。三、基本原理霉菌可產(chǎn)生復(fù)雜分枝的菌絲體，分為基生菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長到一定階段后分化產(chǎn)生繁殖菌絲