茶樹多酚氧化酶基因分型的sscp分析

根據(jù)人類科學(xué)研究的大量遺傳信息，人類血漿培養(yǎng)序列的突變與遺傳形態(tài)直接相關(guān)。根據(jù)人類育種計劃產(chǎn)生的大量遺傳信息，人類疾病的來源是相關(guān)基因的單態(tài)突變。多酚氧化酶（ppo）在茶葉加工中發(fā)揮著非常重要的作用。其活性也是決定茶類適應(yīng)性的重要指標。不同品種的ppo活性的差異必須與ppo基因的突變密切相關(guān)。作者首次研究了不同茶類優(yōu)質(zhì)基因的snov，這是為了進一步探索與ppo活性不同的dna突變，這對茶類新品種的改良中茶類適應(yīng)性的早期鑒定非常重要。這為茶類資源的分子特征提供了理論和實踐的指導(dǎo)。1材料和方法1.1供試材料40個茶樹品種(系)分別采自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所、湖南郴州茶樹良種繁殖示范場:蘋云,櫧葉齊,福鼎大毫,云南大葉,廣西78-2,龍井43,黔湄809,長葉白毫,白毛2號,潮安大烏葉,祁門4號,金觀音,英紅9號,黃葉水仙,福鼎大白茶,八仙茶,云南紅芽,優(yōu)18號,優(yōu)19號,優(yōu)17號,優(yōu)20號,優(yōu)15號,印6號,印5號,斯2號,斯1號,白毫早,佛手,茗豐,高橋早,福毫,福云6號,梅占,東湖早,政和大白茶,毛蟹,不知春,碧香早,迎霜,烏牛早.供試材料于-70℃冰箱中保存.1.2方法1.2.1sscp分析根據(jù)文獻公布的cDNA序列(設(shè)為對照),采用Genetool軟件設(shè)計引物.依PCR-SSCP對SNP分析要求DNA序列長度為200bp左右的特點,共設(shè)計5對引物(表1),交上海生物工程公司合成.25μLPCR反應(yīng)體系包括100ng基因組DNA,1×PCRbuffer,0.5μmol/L正、反向引物,0.15mmol/LdNTPs,1.5mmol/LMgCl2,1UTaqDNApolymerase(所有試劑從晶美生物工程公司購買).PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4min,94℃變性40s,最佳退火溫度退火50s,72℃延伸1min,32個循環(huán),最后于72℃延伸7min.PCR產(chǎn)物采用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行SSCP分析,對不同供試材料作初步基因分型[7,8,9,10,11,12,13].1.2.2序列比和測序通過反雙類分析測序?qū)CR-SSCP分析所區(qū)分的不同基因型分別挑選有代表性的品種(系),再作PCR擴增,將擴增產(chǎn)物送博亞生物技術(shù)公司進行正反雙向測序.采用DNASTARProgram,將測序序列與對照序列進行同源性比較,搜尋SNP和導(dǎo)致酶切位點變異的SNP及導(dǎo)致氨基酸變異的SNP.對序列比對發(fā)現(xiàn)的SNPs位點再重復(fù)測序1次,以提高結(jié)果的準確性.2結(jié)果與分析2.1多態(tài)性引物擴增片段的sscp分析采用優(yōu)化建立的PCR-SSCP-銀染分析技術(shù),對供試材料PPO基因的單鏈構(gòu)象多態(tài)性進行檢測的結(jié)果表明,不同品種之間存在豐富的單鏈構(gòu)象多態(tài)性.其中在引物3～5擴增區(qū)段的多態(tài)性比保守序列區(qū)(第1～2引物擴增區(qū)段)的豐富.圖1是引物1擴增片段的SSCP分析結(jié)果,20個供試材料在此引物擴增區(qū)段被明顯區(qū)分為3種不同的帶型.2.2廣西snps位點對根據(jù)PCR-SSCP分型分析所選定的品種(系)進行擴增并測序,通過與CK序列作同源性比較后,從各引物擴增片段中搜尋到的SNPs列于表2.在引物1擴增區(qū)段有3個SNPs位點,其中優(yōu)20號在第31位有A→G的轉(zhuǎn)換;第63位八仙茶有G→C的顛換,優(yōu)17號、迎霜在此位點均為雜合子(G/C);第64位政和大白茶為雜合子(C/T).在引物2擴增區(qū)段有5個SNPs位點,其中第21位優(yōu)20號、優(yōu)15號、東湖早為雜合子(A/G);第85位優(yōu)15號為雜合子(A/G);櫧葉齊在第131位有C→T的轉(zhuǎn)換;優(yōu)20號、印6號在此位點為雜合子(C/T);第141位優(yōu)20號、印6號、東湖早均為雜合子(G/A);第152位不知春有C→T的轉(zhuǎn)換,政和大白茶為雜合子(C/T).在引物3擴增區(qū)段有7個SNPs位點,其中印5號在第31位有G→T的顛換,優(yōu)18號為雜合子;第42位金觀音、八仙茶為雜合子(C/T);第74位優(yōu)18號為雜合子(A/G);第77位八仙茶為雜合子(G/T);第128位印5號有T→A的顛換,優(yōu)18號、優(yōu)20號為雜合子(T/A);第133位八仙茶為雜合子(G/T);135位金觀音、八仙茶、優(yōu)18號均為雜合子(C/T).在引物4擴增區(qū)段有8個SNPs位點,其中迎霜在第34位為雜合子(A/G);第56位八仙茶有C→T的轉(zhuǎn)換,福鼎大白茶、福云6號、毛蟹、迎霜為雜合子(C/T);第59位八仙茶為雜合子(G/A);第63位云南大葉、英紅9號有G→T的顛換,蘋云為雜合子(G/T);第64位毛蟹為雜合子(G/T);第73位優(yōu)19號、毛蟹、迎霜均為雜合子(A/C);第91位福鼎大白茶、優(yōu)19號、茗豐、毛蟹、迎霜均為雜合子(C/T);第110位福鼎大白茶、優(yōu)19號有A→T的顛換,蘋云、云南大葉、英紅9號、黃葉水仙、茗豐、毛蟹均為雜合子(A/T).在引物5擴增區(qū)段有14個SNPs位點,其中第22位政和大白茶為雜合子(C/T);第24位云南大葉有A→G的轉(zhuǎn)換,廣西78-2為雜合子(A/G);第31位不知春有C→T的轉(zhuǎn)換;第33位云南大葉、廣西78-2有T→C的轉(zhuǎn)換;第42位祁門4號、不知春有G→A的轉(zhuǎn)換;52位政和大白茶有C→G的顛換;第60位廣西78-2為雜合子(A/T);第72位云南大葉為雜合子(C/T);第77位云南大葉、廣西78-2、祁門4號、優(yōu)20號、不知春有G→T的顛換,東湖早、政和大白茶為雜合子(G/T);第83位政和大白茶為雜合子(T/C);第108位廣西78-2為雜合子(T/C);第114位政和大白茶為雜合子(T/C);第174位優(yōu)20號為雜合子(A/G);第184位廣西78-2有A→G的轉(zhuǎn)換.圖2列舉了DNA測序圖譜中的2個SNPs位點.在引物3擴增區(qū)域的128位,金觀音與印6號為T堿基(同CK),優(yōu)18號為T堿基與A堿基的雜合子(以N表示),而印5號則為A堿基.在135位印6號與印5號為C堿基(同CK),而金觀音與優(yōu)18號為C堿基與T堿基的雜合子.在此擴增區(qū)域的128位至135位的8個堿基長度內(nèi)有2個SNP位點,表明茶樹PPO基因在此區(qū)段單核苷酸多態(tài)性豐富.2.3pcr擴增區(qū)域tavi酶切位點的消失在37個SNPs中,有13個位點導(dǎo)致了酶切位點的消失或產(chǎn)生(表3).如引物1擴增區(qū)域的第63位由于G→C的顛換,產(chǎn)生了1個新的核酸限制性內(nèi)切酶酶切位點,該內(nèi)切酶為BsuRⅠ.引物4擴增區(qū)域的56位原本有1個HpaⅡ酶切位點,由于C→T的轉(zhuǎn)換,使該酶切位點消失.引物5擴增區(qū)域的第24位、42位、52位、174位均導(dǎo)致了TaqI酶切位點的消失,第72位導(dǎo)致了HpaⅡ酶切位點的消失.2.4各物4擴增區(qū)域不同突變量的比對在37個SNPs中,共有10個品種(系)在10個位點發(fā)生了氨基酸序列變異(表4),其中八仙茶在引物1與引物4擴增區(qū)域,各有1處錯義突變,分別為絲氨酸突變?yōu)樘K氨酸,絲氨酸突變?yōu)楸奖彼?不知春在引物2與引物5擴增區(qū)域,也各有1處錯義突變,分別為精氨酸突變?yōu)榘腚装彼?脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸.其他因單核苷酸變異而導(dǎo)致氨基酸變異的品種(系)還有櫧葉齊、印5號、云南大葉、英紅9號、福鼎大白茶、優(yōu)19號、政和大白茶、廣西78-2.3品種系的基因型及雜合子和基因型分析本研究以在GenBank中公布的茶樹PPO基因的部分序列為模板,從序列的54位至902位設(shè)計5對最適引物,共跨越849個堿基,在不同引物擴增區(qū)域分別選擇經(jīng)PCR-SSCP分型分析篩選后的品種(系)測序,經(jīng)同源性比較的結(jié)果表明,在茶樹PPO基因中,不同品種之間存在豐富的SNP.共發(fā)現(xiàn)SNP位點37個,即平均每23個堿基就有1個SNP.從第1至第5擴增區(qū)段SNP的出現(xiàn)頻率分別為1.68%,2.82%,3.22%,4.10%,6.08%.很顯然,在PPO基因保守序列存在的第1～2區(qū)段,SNP出現(xiàn)的頻率較低.在茶樹PPO基因中出現(xiàn)如此高頻率的SNP應(yīng)該與茶樹長期異花授粉導(dǎo)致的高度異質(zhì)性相關(guān),同時所選試驗材料囊括了不同生態(tài)群的40個品種(系),其遺傳背景十分復(fù)雜,且PPO活性差異懸殊.SNP常表現(xiàn)為核苷酸的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失,但通常所指的SNP不包括后兩種情況.因此,SNP主要有嘌呤與嘌呤或嘧啶與嘧啶之間的轉(zhuǎn)換類型(包括C?T,A?G)及嘌呤與嘧啶之間的顛換類型(包括A?C,A?T,G?C,G?T).由于核苷酸的5-甲基胞嘧啶脫氨基反應(yīng)相對比較頻繁,使各類SNP在基因組中出現(xiàn)的頻率不同,通常生物體中約2/3是轉(zhuǎn)換類型.發(fā)現(xiàn)的37個SNPs中,轉(zhuǎn)換變異為10個,源于試驗品種(系)的親本之一有轉(zhuǎn)換變異的雜合子(如C/T,A/G)為10個,二者共計25個,占67.57%;顛換變異為7個,源于試驗品種(系)的親本之一有顛換變異的雜合子(如G/T,A/T,A/C,G/C)為5個,二者共計12個,占32.43%.這與通常生物體基因組中SNP的發(fā)生約2/3為轉(zhuǎn)換變異相符合.本研究發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)換類型包括A?G,C?T,顛換類型包括A?T,G?C,G→T,A→C.在基因的編碼序列中,SNP大多位于密碼子的搖擺位置,表現(xiàn)為沉默突變.發(fā)現(xiàn)的37個SNPs中,有10個位點為錯義突變導(dǎo)致氨基酸的改變,占SNP總數(shù)的27.03%.在新等位基因分析時,依據(jù)GenBank中同一基因的氨基酸序列,若基因中的核苷酸變異引起了新的氨基酸產(chǎn)生,即認為是1個新的等位基因.本研究的結(jié)果表明,茶樹PPO基因有許多等位基因.茶樹品種存在明顯的茶類適制特性,有的品種由于其PPO活性高,制紅茶品質(zhì)好,而有的品種只能制綠茶,若制紅茶,則難于發(fā)酵.不同茶樹品種之間所表現(xiàn)出的各不相同的PPO活性,應(yīng)該與PPO基因存在豐富的等位基因有關(guān).理論上,在一個二倍體生物群體中,SNP可以由雙等位、三等位或四等位基因構(gòu)成,但實際上三等位或