白癜風(fēng)中藥復(fù)方對酪氨酸酶活性的影響

酪氨酸酶（tyr）是皮膚黑素生物合成的主要酶，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為銅和糖蛋白。在皮膚黑素生物合成過程中,酪氨酸羥化生成多巴,多巴氧化生成多巴醌,二羥基吲哚轉(zhuǎn)化生成吲哚醌,這些反應(yīng)步驟均需TYR參與;無TYR時,反應(yīng)則變得非常緩慢。TYR活性與黑素合成量呈正相關(guān),TYR活性改變可引起色素障礙性皮膚病如白癜風(fēng),基因突變則可引起白化病。為了研究中藥對酪氨酸酶活性的作用,我們選擇100冊古籍專著和50種中醫(yī)藥雜志近30年文獻(xiàn),電腦統(tǒng)計選定古方中治療白癜風(fēng)應(yīng)用頻次較高的復(fù)方中藥5首,分別測定其水提液、醇提液對酪氨酸酶活性的影響。1材料和方法1.1儀器722分光光度計(上海第三分析儀器廠生產(chǎn))。1.2dl-多巴試劑蘑菇酪氨酸酶(tyrosinase.EC.1.14.18.),DL-多巴(DL-β-3,4-dopa),均購自美國Sigma公司),其它試劑均為分析純。1.3特效藥1.3.1中藥鑒定標(biāo)準(zhǔn)治療白癜風(fēng)中藥復(fù)方白駁片、白癜風(fēng)丸、柴胡疏肝湯、通竅活血湯、白蝕丸由南京中醫(yī)藥大學(xué)門診部提供,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室王春根教授鑒定,符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定。1.3.2治療地膚子、刺擴白駁片:紫草、降香、重樓、白藥子、白薇、蒼術(shù)、海螵蛸、紅花、桃仁、生首烏、龍膽草、白蒺藜、甘草。白癜風(fēng)丸:補骨脂、當(dāng)歸、地膚子、刺蒺藜。通竅活血湯:赤芍、川芎、桃仁、紅花、鮮姜、老蔥白、紅棗、麝香。柴胡疏肝湯:川芎、當(dāng)歸、赤芍、生地、柴胡、黃芩、山梔子、天花粉、防風(fēng)、牛蒂子、連翹、甘草。白蝕丸:紅花、丹皮、紫草、蒼術(shù)、白蒺藜、龍膽草、甘草、補骨脂、首烏、丹參、靈芝。1.3.3u3000制備工藝(1)醇提液:中藥粉碎后用90%乙醇溶液浸泡,3h后回流過濾,再將殘渣提取2次,合并提取液,置沸水浴中揮盡乙醇濃縮至膏稠狀,然后溶于含2%DMSO0.05mol/LpH6.5磷酸緩沖液中,制成每mL相當(dāng)于0.1g原生藥的溶液。(2)水提液:取中藥置玻璃燒杯內(nèi),加相當(dāng)于藥材量5～7倍的蒸餾水浸泡1～2h,煮沸30min過濾。藥渣加3～5倍量水繼續(xù)煎煮,煮沸20min,過濾。合并兩次濾液,于水浴上濃縮成每mL相當(dāng)于原藥材0.1g的藥液。若處方中有需先煎、后下、包煎、另煎和烊化等藥材,則按常規(guī)處理。1.4實驗方法1.4.1u3000添加dmso后菇酪氨酸酶活力采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法檢測酪氨酸酶活性。反應(yīng)混合物2mL:0.1mol/LpH6.5PBS1.8mL+藥物0.1mL(濃度0.1g/mL)+蘑菇酪氨酸酶0.1mL(80U)。37℃孵育10min,加0.15%DL-多巴1mL,2、3、4、5、6min時,用分光光度計475nm處測定吸光度A值(A475),以每分鐘A475增加0.001定為1個酶活力單位。醇提物用DMSO助溶。以PBS液為空白,水提液以不加藥物的反應(yīng)組為對照,醇提液以不加藥物含2%DMSO的反應(yīng)組為對照,分別測定酪氨酸酶活性。1.4.2數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計數(shù)據(jù)的方法上述每一實驗重復(fù)3次。所測實驗數(shù)據(jù)以(χ±s)表示,采用成組t檢驗,使用Office97excel軟件作數(shù)據(jù)處理及分析。2結(jié)果2.1酪氨酸酶活性測定治療白癜風(fēng)中藥復(fù)方中,白癜風(fēng)丸、柴胡疏肝湯、白駁片、白蝕丸組酪氨酸酶活性增高(P<0.01)。其中,白癜風(fēng)丸對酪氨酸酶活性的激活作用最強,柴胡疏肝湯、白駁片次之,白蝕丸較弱,結(jié)果見表1。2.2抗膽紅素對蘑菇酪氨酸酶活性的影響白癜風(fēng)丸組方中藥補骨脂、當(dāng)歸、地膚子、刺蒺藜對酪氨酸酶活性均有激活作用,其中補骨脂較高,刺蒺藜次之,當(dāng)歸、地膚子較弱,結(jié)果見表2。3不同中藥復(fù)方治療對酪氨酸酶活性的影響業(yè)已證實上調(diào)酪氨酸酶活性加速黑素生成的藥物可提高白癜風(fēng)治療效果,但其機制不清。Cui等認(rèn)為毛囊外根鞘部存在無功能黑素細(xì)胞(MC),以毛囊中下部居多。白癜風(fēng)表皮內(nèi)MC完全消失,毛囊球部和漏斗部有色素MC被破壞,但毛囊外根鞘內(nèi)無功能MC存在,其數(shù)量和分布與正常相近。白癜風(fēng)恢復(fù)時,表皮內(nèi)出現(xiàn)新生有功能MC,毛囊外根鞘內(nèi)無功能MC較正常和白癜風(fēng)時明顯增多,而且出現(xiàn)了有功能MC?；謴?fù)過程首先開始于毛囊中下部。藥物可能刺激外根鞘內(nèi)無功能MC。使其分裂增殖,并沿毛囊外根鞘表面向上移行,進(jìn)入表皮。在其移行過程中,MC功能和形態(tài)逐漸成熟,多巴反應(yīng)由弱到強,分支增多延長。進(jìn)入表皮后,MC以毛囊孔為中心繼續(xù)向周圍擴展,形成臨床上所見的毛囊孔性色素小島。中藥復(fù)方是中醫(yī)臨床防病治病的主要形式,是中醫(yī)扶正祛邪、辨證論治的集中體現(xiàn)和中醫(yī)治法治則在組方用藥上的具體應(yīng)用。我們選取白癜風(fēng)治療中使用頻次較高的復(fù)方中藥5首,分別測定其水提液、醇提液對酪氨酸酶活性的影響。結(jié)果顯示白癜風(fēng)丸、柴胡疏肝湯、白駁片、白蝕丸組酪氨酸酶活性增高(P<0.01)。提示白癜風(fēng)丸等治療白癜風(fēng)中藥復(fù)方對酪氨酸酶活性有顯著激活作用。白癜風(fēng)丸行血活血、散風(fēng)解毒、祛風(fēng)除斑,可使酪氨酸酶活性顯著增高,是中醫(yī)治療白癜風(fēng)主要復(fù)方。實驗中發(fā)現(xiàn),其組方中藥補骨脂、當(dāng)歸、地膚子、刺蒺藜均上調(diào)酪氨酸酶活性且能發(fā)揮協(xié)同作用;從中醫(yī)組方原則來看,當(dāng)歸補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤燥滑腸;刺蒺藜平肝舒郁、祛風(fēng)活血、疏肝理氣;地膚子清熱利濕祛風(fēng);補骨脂滋肝補骨助陽。諸藥配伍,補中有通,益中有泄,共奏調(diào)和氣血、榮膚祛白之功效。司在和等應(yīng)用白癜風(fēng)丸治療白癜風(fēng)患者,每日2次,每次6～9g,療程9個月,共100例,痊愈38例,顯效25例,有效18例,無效19例。馮所安等應(yīng)用白蝕丸口服,每日3次,每次10粒,療程3月,共治療458例白癜風(fēng)患者,顯效61例,有效264例,無效133例,總有效率70.90%。王專勤等應(yīng)用白駁片治療白癜風(fēng)患者79例,痊愈37例,顯效17例,有效12例,無效13例。白癜風(fēng)丸、白駁片、白蝕丸等主要由滋補、性溫