狼毒浸出液對小鼠肝癌的抑制作用

現(xiàn)在，大多數(shù)肝細(xì)胞疾病都使用手術(shù)、放療、化療和生物治療。由于肝腫瘤通常在發(fā)現(xiàn)后不久失去手術(shù)的可能性，并且治療和放療的效果不佳，對肝臟有一定的毒性反應(yīng)，因此患者無法耐受。中藥狼毒具有免疫調(diào)節(jié)作用及細(xì)胞毒性作用,而且毒性低、價廉、制作簡單,病人易于接受。為此,我們觀察了狼毒浸出液的體內(nèi)和體外的抗肝癌作用及其機制?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。1材料和方法1.1實驗動物采用CFW近交系小鼠,體重20～30g,2～3月齡,雌雄各半,隨機分組,每組小鼠數(shù)詳見實驗方法。1.2h2細(xì)胞的誘導(dǎo)誘導(dǎo)誘導(dǎo)誘導(dǎo)誘導(dǎo)小鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力小鼠腹水型肝癌(H22),由北京中醫(yī)藥大學(xué)引進(jìn),昆明種小鼠,腹腔內(nèi)接種,常規(guī)保種傳代。H22/F23系將H22細(xì)胞移植到615小鼠腹腔,通過腹腔-皮下-淋巴結(jié)-腹腔,在體內(nèi)反復(fù)循環(huán)篩選23次后而得,選擇后的腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力顯著提高,轉(zhuǎn)移率在68%左右。H22和H22/F23在用于本實驗前均在CWF近交小鼠接種傳代3次。1.3主要藥物和試劑1.3.1狼毒提取物yf-1取狼毒生藥20g,加重蒸餾水100ml,煮沸后文火煎15min,放入冰箱備用。1.3.2氨基酸苯磺酸鹽heps內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)為15%～20%NBS,20mmol/LHeps液,2mmol/L谷氨酸胺,5×10-5mmol/L2-巰基丙醇,1.2g/L碳酸氫鈉,青、鏈霉素各1萬單位/L.1.4實驗方法1.4.1腫瘤細(xì)胞的制備抽取傳代后第6天的H22和H22/F23瘤性腹水,生理鹽水調(diào)腫瘤細(xì)胞濃度至108/L,備用。1.4.2yf-1對小鼠胃計劃缺陷的抑瘤率將40只CFW小鼠隨機分成4組:①第1,2組,用H22細(xì)胞105個/只接種于小鼠腹腔;②第3,4組,用H22/F23細(xì)胞105個/只接種于小鼠腹腔。③1,3組為治療組,自第2～8天,每只小鼠胃管內(nèi)注入0.3ml(0.06g)YF-1;④2,4組為對照組,自第2～8天,每只小鼠胃管內(nèi)注人0.3ml生理鹽水。15d后處死動物,稱局部瘤質(zhì)量,對照組的平均瘤質(zhì)量減去治療組的平均瘤質(zhì)量,代表了YF-1對兩種腫瘤的抑制程度,該值與對照組瘤質(zhì)量均值之比即為抑瘤率。取同側(cè)腹股溝、腋窩淋巴結(jié)切片染色,按文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度。1.4.3yf-1對小鼠血清中f3細(xì)胞表達(dá)的影響用RPMI-1640全培養(yǎng)基調(diào)H22,H22/F23細(xì)胞濃度至2×105/ml,與同體積YF-1水劑混合,置37℃水浴60min,取0.1ml注射于受試小鼠腹腔,觀察小鼠存活情況。1.4.4細(xì)胞藍(lán)染率測定H22/F23,H22細(xì)胞懸浮液1ml(2×105/ml)與同體積YF-1水劑混合,置37℃水浴60min,每隔5min檢測細(xì)胞的藍(lán)染率。藍(lán)染系指用苔盼藍(lán)染色,死亡細(xì)胞染成藍(lán)色,藍(lán)染率即為腫瘤細(xì)胞的死亡率,代表了YF-1對H22,H22/F23瘤細(xì)胞的殺傷率。1.5觀察項目每日觀察動物的一般狀態(tài),記錄動物的死亡時間,解剖主要臟器、瘤體及主要部位的淋巴結(jié),并稱質(zhì)量,對標(biāo)本進(jìn)行病理切片。2結(jié)果2.1/c332/c33對照組小鼠平均存活時間H22為17.3±1.3d,H22/F23為16.1±2.1d;而YF-1治療組時間分別為24.0±5.6d,22.0±3.8d,兩組比較差異均有顯著性(t=3.16,3.04,P均<0.05)。2.2抑瘤率種瘤后15d處死動物,稱瘤質(zhì)量,YF-1對H22,H22/F23的抑瘤率分別為67.9%,64.6%,兩組比較差異無顯著性(t=0.676,P>0.05)。2.3yf-1對p2和p23淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響治療組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率20.0%,對照組53.3%,兩者比較差異有顯著性(t=3.163,P<0.05)。2.4瘤鼠長期生存對照組動物攻擊后,25d內(nèi)全部死亡,治療組10%瘤鼠長期生存(>60d);治療組平均生存時間為38.0±0.2d,對照組為14.8±6.1d,兩組比較差異有顯著性(t=2.98,P<0.05)。2.5yf-1對p2和p23細(xì)胞的外包毒性作用YF-1分別與H22,H22/F23瘤細(xì)胞混合培養(yǎng),在37℃下,自混合至60min時,瘤細(xì)胞的藍(lán)染率均在10%以下。3小鼠淋巴道轉(zhuǎn)移模型目前,腫瘤的治療仍為綜合治療,腫瘤的中醫(yī)治療作為輔助治療,可以降低綜合治療毒性反應(yīng),清除體內(nèi)殘留腫瘤病灶,改善病人一般狀況,尤其對難治復(fù)發(fā)耐藥的腫瘤有重要意義。狼毒系用植物瑞香狼毒(stellerachamajasmeL)根,采用傳統(tǒng)方法煎制而成。研究表明,狼毒對白血病細(xì)胞具有明顯的抑制作用。H22/F23為小鼠腹水型肝癌(H22)經(jīng)淋巴道反復(fù)篩選接種23代建立的淋巴道轉(zhuǎn)移模型,其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高達(dá)66%,業(yè)已證明,其免疫原性較低,其轉(zhuǎn)移能力的增強可能與此有關(guān)。本文結(jié)果顯示,YF-1能夠抑制其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,表明YF-1可能通過免疫機制抑制腫瘤生長。本文結(jié)果亦顯示,狼毒浸出液能使荷瘤鼠生存時間延長,瘤體縮小,且尚能降低H22/F23的動物模型的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和轉(zhuǎn)移程度。YF-1的中和實驗中,經(jīng)體外YF-1的直接細(xì)胞毒作用,接種于小鼠后,不僅能使荷瘤鼠生存時間延長,而且有10%的瘤鼠長期生存。表明狼毒浸出液對癌細(xì)胞有直接殺傷作用,且這種作用較持久、較強烈,該作用在相繼的體內(nèi)實驗中又得到延伸和印證。體外細(xì)胞毒實驗表明,YF-1與兩種瘤細(xì)胞混合培