沙門菌檢查法1簡述沙門菌屬是腸桿菌科的重要致病菌，按Bergey系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊第一卷（1984），沙門菌分5個亞屬。出版的第八版的臨床微生物手冊將沙門菌屬分成兩個菌種即腸炎沙門菌和乍得沙門菌，其中腸炎沙門菌分6個亞種，涉及常見的傷寒、甲型副傷寒、乙型副傷寒、丙型副傷寒、，鼠傷寒，豬霍亂等沙門菌雜內(nèi)，迄今已發(fā)現(xiàn)2501個血清型。O抗原抗血清A-E群包含了沙門菌分離株的95%，因此慣用沙門菌A-FO多價血清進(jìn)行沙門菌初篩實驗。藥品中的沙門菌，是以鑒定沙門菌屬為準(zhǔn)，即對沒10g（或10ml）藥品中與否檢出沙門菌作出檢查報告。由于沙門菌血清型繁多，各血清型的生化及血清學(xué)特性雖親密有關(guān)，卻不盡相似，采用一種增菌培養(yǎng)基和兩種分離培養(yǎng)基，不可能涵蓋全部沙門菌的最適增菌及分離條件。另外，由于藥品在生產(chǎn)過程中，常受到加熱、干燥等加工環(huán)節(jié)的影響，藥品中污染的沙門菌可受到損傷或呈休眠狀態(tài)，故須在增菌培養(yǎng)前先進(jìn)行預(yù)增菌。然后再進(jìn)行增菌及分離、三糖鐵瓊脂初步鑒別、生化實驗、血清學(xué)實驗等環(huán)節(jié)。2儀器、設(shè)備及用品（見大腸埃希菌2）。3試液批示液（參見大腸埃希菌3）3.1無菌脲試液[附錄2.5]。3.2酚磺酞批示液[附錄4.4]。3.3亮綠試液[附錄2.9]。3.4氰化鉀試液[附錄2.14]。3.5溴甲酚紫批示液[附錄4.5]。3.6革蘭染色液[附錄2.4，2.10，2.16]。3.7沙門菌屬A-F“O”多價血清（即O多價1）生物制品研究所供應(yīng)。4培養(yǎng)基4.1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[附錄5.2]。4.2營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基[附錄5.1]。4.3半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[附錄5.3]。4.4曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）[附錄5.8]。4.5麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacC）[附錄5.9]。4.6四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTB）[附錄5.11]。4.7三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TSI）[附錄5.10]。4.8膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基（DHL）[附錄5.13]。4.9沙門菌屬志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（SS）[附錄5.12]。4.10蛋白胨水培養(yǎng)基[附錄5.18]。4.11脲（尿素）瓊脂培養(yǎng)基[附錄5.23]。4.12氰化鉀培養(yǎng)基[附錄5.24]。4.13賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基[附錄5.25]。5對照用菌液取乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50094]是營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少量，接種至5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)18～24h后，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至1:106（濃度相稱于50～100cfu/0.1ml），作陽性對照用菌液。其菌液濃度可用平板菌落計數(shù)法測得。即取0.1ml加入平皿內(nèi)，傾注營養(yǎng)瓊脂，混勻，或以0.1ml均勻涂布于事先準(zhǔn)備好的營養(yǎng)瓊脂平板上，經(jīng)培養(yǎng)后點(diǎn)計求得。6操作辦法6.1準(zhǔn)備工作：（見細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)6）。6.2供試液的制備：（見細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)7）。含抑菌成分供試品供試液的制備：（見大腸埃希菌6.2）。6.3陽性對照實驗、陰性對照實驗（見大腸埃希菌7.1）。6.4增菌培養(yǎng)6.4.1預(yù)增菌取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基2份，每份200ml，1份加入10g或者10ml供試品使勻，另1份加入稀釋劑10ml作陰性對照，36℃±1℃培養(yǎng)18～24h，觀察。搖動陰性對照瓶后應(yīng)清亮透明，無菌生長。6.4.2增菌培養(yǎng)輕微搖動供試品增菌培養(yǎng)瓶，吸取1ml接種于1管含10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)18～24h。6.5分離培養(yǎng)輕微搖動供試品增菌培養(yǎng)，以接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液劃線于膽鹽硫乳瓊脂（DHL）或沙門菌志賀菌瓊脂（SS）平板及曙紅亞甲藍(lán)（EMB）瓊脂或麥康凱瓊脂平板各1個，倒置培養(yǎng)24～48h。檢查平板上有無疑似沙門菌菌落。沙門菌在上述平板上的菌落形態(tài)特性見表1。表1沙門菌的菌落特性平板菌落形態(tài)膽鹽硫乳瓊脂（DHL）無色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色沙門菌屬志賀菌屬瓊脂（SS）無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時帶黑褐色曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB）無色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤的圓形菌落麥康凱瓊脂（MacC）無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時為暗色由于沙門菌不發(fā)酵乳糖和蔗糖，不產(chǎn)酸，菌落不著色，普通為無色半透明，多數(shù)沙門菌因產(chǎn)生H2S，菌落中心呈現(xiàn)黑色甚至全黑色，在DHL瓊脂平板上較為明顯。在SS瓊脂平板上，H2S特性有時不明顯，沙門菌屬亞屬Ⅲ因多數(shù)菌株發(fā)酵乳糖，故在上述平板上的乳糖發(fā)酵菌落呈現(xiàn)粉紅或紫色，但由于產(chǎn)生H2S，在有H2S批示系統(tǒng)的平板上仍出現(xiàn)黑色中心。在上述培養(yǎng)基上，有些非沙門菌屬細(xì)菌，也可呈現(xiàn)類似沙門菌菌落形態(tài)，須進(jìn)一步鑒別。由于藥品的影響或非典型菌株的存在，沙門菌菌落可呈現(xiàn)非典型形態(tài)，如色澤變深，菌落粗糙等，應(yīng)注意分辨。6.6初步鑒別實驗從每個供試品的分離平板上挑取2～3個疑似菌落（菌落形態(tài)特性與表1所列的形態(tài)特性相符或疑似）分別接種于三糖鐵瓊脂斜面，接種時應(yīng)以接種針輕輕接觸單個菌落中心部位，沾取培養(yǎng)物劃線于三糖鐵瓊脂斜面并穿刺終究層或先穿刺底層再劃線斜面，培養(yǎng)18～24h，觀察成果。疑似沙門菌在三糖鐵瓊脂斜面上的反映為：①斜面紅色（產(chǎn)堿），底層黑色（產(chǎn)H2S）并顯示黃色（產(chǎn)酸）；②斜面紅色，底層黃色；③斜面黃色，底層黑色，并顯示黃色。多數(shù)沙門菌在三糖鐵瓊脂上產(chǎn)憤怒體，使底層瓊脂出現(xiàn)氣泡或使瓊脂斷裂，但也有不產(chǎn)憤怒體的菌種。對在三糖鐵瓊脂斜面黃色并同時底層無黑色，或斜面及底層均為紅色者能夠排除沙門菌。將疑似沙門菌的三糖鐵瓊脂或營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作生化實驗，血清凝集實驗及革蘭染色，鏡檢。沙門菌應(yīng)為革蘭性桿菌。6.7生化實驗6.7.1靛基質(zhì)實驗用接種環(huán)沾取少量培養(yǎng)物，接種到蛋白胨水培養(yǎng)基中，照大腸埃希菌靛基質(zhì)實驗項下操作、判斷成果。沙門菌應(yīng)為陰性反映。6.7.2脲酶實驗用接種環(huán)沾取少量培養(yǎng)物，劃線接種于脲瓊脂斜面，培養(yǎng)24h，觀察成果。斜面變?yōu)榧t色為陽性反映，沙門菌屬為陰性反映。6.7.3氰化鉀實驗竟培養(yǎng)物先接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～24h，用接種環(huán)沾取培養(yǎng)液1環(huán)，接種至氰化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，另取一環(huán)培養(yǎng)液接種于不含氰化鉀的同樣培養(yǎng)基內(nèi)作對照管，接種后即以橡膠塞塞緊，培養(yǎng)24～48h，觀察成果。對照管內(nèi)有菌生長（渾濁），而實驗管也有菌生長為陽性反映；對照管有菌生長（渾濁）而實驗管無菌生長（清亮）為陰性反映。沙門菌應(yīng)為陰性反映。本實驗應(yīng)十分注意密封管口，夏天分裝培養(yǎng)基宜在冰浴中進(jìn)行，避免氯化鉀分解，產(chǎn)生氫氰酸逸出，致使培養(yǎng)基內(nèi)氰化鉀濃度減少，不能克制細(xì)菌生長，造成假陽性。氰化鉀為劇毒品、操作時須謹(jǐn)慎，切勿用口吸液。用后的培養(yǎng)基，每管加數(shù)粒硫酸亞鐵和20%氫氧化鉀0.5ml，去毒，然后再滅菌，洗滌。6.7.4賴氨酸脫羧酶實驗用接種環(huán)沾取少量培養(yǎng)物，接種在賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基中，同時接種一支不含賴氨酸的同樣培養(yǎng)基作為對照管，培養(yǎng)24～48h觀察成果。對照管黃色（產(chǎn)酸），實驗管呈紫色為陽性反映（賴氨酸脫羧酶產(chǎn)堿）；實驗管黃色為陰性反映。沙門菌應(yīng)為陽性反映。6.7.5動力實驗用接種針沾取培養(yǎng)物，穿刺接種于半固體營養(yǎng)瓊脂管中，培養(yǎng)24h，觀察成果。有動力的細(xì)菌能在穿刺線以外的培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散生長使培養(yǎng)基呈渾濁現(xiàn)象；無動力的細(xì)菌僅能沿穿刺線生長，不向外擴(kuò)散，培養(yǎng)基仍呈清晰透明狀；無動力體現(xiàn)的培養(yǎng)物，應(yīng)在室溫保存2～3天后，再行觀察。沙門菌除雞雛沙門菌及無動力的變種外，均含有周身鞭毛，能運(yùn)動，動力實驗陽性。沙門菌生化反映的初步鑒別見表2表2沙門菌與有關(guān)細(xì)菌在三糖鐵瓊脂及初步生化實驗的鑒別序號三糖鐵瓊脂靛基質(zhì)脲酶氰化鉀賴氨酸脫羧酶鑒定菌屬斜面產(chǎn)層產(chǎn)氣硫化氫1.1－＋＋/－＋/－－－－＋沙門菌屬1.2＋/－＋＋＋－－－＋沙門菌屬Ⅲ2－＋＋/－＋＋－－＋緩慢愛德華菌屬3＋/－＋＋/－＋/－－/＋－/＋＋/－－弗勞地檸檬酸桿菌4.1－＋＋S＋－＋＋－奇異變形桿菌4.2－＋＋/－S＋＋＋＋－普通變形桿菌5＋/－＋＋/－－＋/－－－＋/－大腸埃希桿菌6－＋－－－/＋－－－志賀菌屬7.1＋＋＋－－＋/－＋－陰溝腸桿菌7.2＋＋＋－－＋/－＋＋肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌8－＋＋S/－－＋＋/－＋－普羅菲登斯菌屬、摩根菌屬9－＋＋/－－－－/＋＋＋蜂房哈夫尼亞菌、粘質(zhì)沙雷菌注：＋產(chǎn)酸（黃色），陽性，陽性率>90%；－產(chǎn)堿（紅色），陰性，陰性率>90%；＋／－多數(shù)陽性、少數(shù)陰性；＋S產(chǎn)生少量氣體（本表根據(jù)何曉青衛(wèi)生防疫細(xì)菌檢查參考第八版美國臨床微生物手冊）；反映序號１.１不產(chǎn)H2S可結(jié)合血清學(xué)凝集實驗，或加做部分生化實驗，鑒定為沙門菌；反映序號１除典型反映外，脲酶、氰化鉀實驗、賴氨酸脫羧酶實驗三項中有一項異常；反映序號２僅靛基質(zhì)陽性。其它狀況可排除沙門菌。6.8血清學(xué)凝集實驗6.8.1準(zhǔn)備1片干凈的滅菌載玻片，在近中央的一端，以直徑3mm接種環(huán)沾取沙門菌屬Ｏ多價1血清2～3環(huán)制成與玻片橫徑相垂直的條形涂抹，長約1.5cm，寬約0.5cm。另一端用生理鹽水替代血清同法操作，作為陰性對照。6.8.2用接種環(huán)分別挑取三糖鐵瓊脂斜面或營養(yǎng)瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物少量，在血清和鹽水中混勻。菌量要適宜，勿過濃。6.8.3將玻片前后傾斜多次，以暗色背景襯底，在良好的照明條件下進(jìn)行觀察，陰性對照不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象都是陽性反映。陽性反映普通在3min內(nèi)發(fā)生。有時因血清效價低、反映緩慢時，應(yīng)將玻片置培養(yǎng)皿內(nèi)，并放一種濕棉球在旁邊，蓋上皿蓋，經(jīng)約20min，再觀察成果。如果仍然沒有出現(xiàn)凝聚，應(yīng)取斜面培養(yǎng)物，置含少量生理鹽水的試管中，制成濃菌懸液，在100℃水浴中保溫30min，以除去可能存在的Vi抗原，待冷，再做凝集實驗，如出現(xiàn)凝集，仍判為陽性反映；如不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則為陰性反映。6.8.4如對照實驗出現(xiàn)凝集現(xiàn)象為非特異反映，須對該菌株培養(yǎng)物進(jìn)行解決后再作凝集實驗。7成果鑒定7.1供試品培養(yǎng)物為革蘭陰性桿菌，三糖鐵瓊脂反映及生化反映符合沙門菌屬反映。多價1血清凝集實驗陽性反映（含待檢培養(yǎng)物經(jīng)100℃30min解決后凝集實驗為陽性反映），報告10g或10ml供試品檢出沙門菌。7.2供試品培養(yǎng)物三糖鐵瓊脂反映或生化反映不符合沙門菌屬反映。多價1血清凝集實驗為陰性反映（含待檢培養(yǎng)物經(jīng)100℃30min解決后凝集實驗為陰性反映），報告10g或10ml供試品未檢出沙門菌。7.3供試品培養(yǎng)物出現(xiàn)下列狀況，應(yīng)繼續(xù)鑒定或保存菌種，送交有關(guān)單位進(jìn)一不鑒定后，再作報告。7.3.1供試品培養(yǎng)物的生化反映符合沙門菌屬反映多價1血清凝集實驗陰性反映。7.3.2供試品培養(yǎng)物的生化反映不符合沙門菌屬反映多價1血清凝集反映呈陽性反映。7.4對已檢出沙門菌的供試品分離的菌種，有條件者，應(yīng)進(jìn)一步作菌型鑒定。根據(jù)檢出菌的特性，推斷可能菌型，增加生化實驗項目及沙門菌單因子血清“O”及“H”進(jìn)行鑒定。8注意事項8.1實驗用培養(yǎng)基，需通過質(zhì)量鑒定，用已知典型反映菌株（如乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50094]進(jìn)行測試，其敏捷度及特性性反映應(yīng)符合規(guī)定。培養(yǎng)基需在規(guī)定條件保存，在規(guī)定時間內(nèi)使用。分離平板在使用應(yīng)置36℃溫箱內(nèi)倒置孵育1～2h，使其表面溫暖濕潤，利于分離。8.2在對供試品進(jìn)行測試的同時，需做陽性菌對照及陰性對照。陰性對照應(yīng)無菌生長，陽性對照應(yīng)顯示陽性成果，否則檢查成果無效。特別是用接種環(huán)沾取菌液進(jìn)行接種或分離時，避免動作過大，形成氣溶膠，污染操作環(huán)境。8.3為確保明驗辦法發(fā)可靠性，對分離平板上的疑似菌落，應(yīng)多選用幾個菌落同時進(jìn)行實驗。挑取菌落時，不要在分離平板菌落密集部位挑取可疑菌落，而應(yīng)在菌落分布稀疏部位挑選。8.4生化實驗及血清學(xué)實驗的被鑒定培養(yǎng)物必須是純培養(yǎng)物，否則，不可能得到對的成果。如遇血清學(xué)凝集實驗陽性而生化實驗不符合時，應(yīng)首先檢查培養(yǎng)物的純度。對已污染的培養(yǎng)物，不應(yīng)丟棄，由于污染菌可能掩蓋沙門菌，故應(yīng)對被污染的培養(yǎng)物重新分離，認(rèn)真選用單個菌落再進(jìn)行實驗。8.5全部生化反映均需按照規(guī)定的實驗規(guī)定進(jìn)行，如觀察三糖鐵瓊脂斜面反映的時間，應(yīng)在24±2h，時間過短過長，都可能出