上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司呼吸道病毒7項(xiàng)檢測(cè)試劑2011-1-10

呼吸道病毒7項(xiàng)檢測(cè)試劑目錄1．概述

②樣本完全風(fēng)干。③在20oC到25oC，用預(yù)冷的100%丙酮固定細(xì)胞約5到10分鐘。注意：丙酮是易揮發(fā)、可燃性物質(zhì)，使用時(shí)請(qǐng)遠(yuǎn)離明火。④從丙酮中取出載玻片并風(fēng)干。⑤在固定并風(fēng)干的細(xì)胞上滴加一滴DFA染色試劑（如圖1），使其完全覆蓋細(xì)胞（注意：2孔或8孔板上有一孔是陰性對(duì)照孔，請(qǐng)勿滴加DFA染色試劑）。⑥在呼吸道病毒抗原對(duì)照板的每孔內(nèi)也要滴加DFA染色試劑?？乖瓕?duì)照板包含了被病毒感染的細(xì)胞和未感染的細(xì)胞，只能一次性使用。⑦在陰性對(duì)照孔內(nèi)滴加正常鼠丙種球蛋白試劑，使其完全覆蓋細(xì)胞。⑧將載玻片放于35oC到37oC的恒溫箱內(nèi)孵育15到30分鐘，為保持其濕潤(rùn)最好放置于帶蓋的盒子內(nèi)。⑨用事先稀釋好的洗液漂洗染色細(xì)胞。為了更有效地洗滌，請(qǐng)將玻片在洗液中反復(fù)浸蘸4次左右。⑩使用新的1X洗液再洗一次。?用去離子水再洗一遍。圖1、在玻璃板上滴加D3UltraDFA染色試劑3、觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果滴加2到3滴固定液，并加蓋蓋玻片（20X50mm），要注意避免產(chǎn)生氣泡。在200倍放大熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。2.5D3UltraDFA試劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀帶FITC標(biāo)記的抗體在熒光顯微鏡下會(huì)呈現(xiàn)明亮的綠色，如果細(xì)胞表面存在病毒抗原，染色后就會(huì)顯綠色。在熒光顯微鏡下，感染不同病毒的細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)獨(dú)有的特征（如圖2）。圖2、顯微鏡下觀察染色細(xì)胞（注：根據(jù)不同熒光顯微鏡，背景色不一定為紅色）3．D3UltraDFA試劑競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)3.1檢驗(yàn)的特異性和靈敏度檢驗(yàn)的特異性:用D3UltraDFA呼吸道病毒篩查和鑒定試劑對(duì)多種細(xì)胞和微生物進(jìn)行交叉反應(yīng)測(cè)試。對(duì)64種病毒、18種細(xì)胞、19種細(xì)菌均沒有交叉反應(yīng)。檢驗(yàn)的靈敏度：熒光標(biāo)記的單克隆抗體平均能檢測(cè)出病毒的最低濃度約為1.0PFU。3.2市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)主要競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手為西班牙Vircell公司的9項(xiàng)呼吸道產(chǎn)品。D3UltraDFA試劑與其主要有兩點(diǎn)不同：1.檢測(cè)項(xiàng)目不同；2.檢測(cè)原理不同1、Vircell產(chǎn)品檢測(cè)項(xiàng)目除了以上7種病毒外，還包含肺炎衣原體、支原體等原核生物檢測(cè)項(xiàng)目。但是，90%的感冒是由病毒引起的。如果是細(xì)菌、衣原體、支原體等感染，一般白細(xì)胞和C-反應(yīng)蛋白（CRP）都會(huì)顯著升高，而病毒感染，這兩項(xiàng)指標(biāo)一般不會(huì)升高。我們建議醫(yī)生可以先做血常規(guī)或者CRP檢測(cè)，這樣就能區(qū)分是病毒還是細(xì)菌感染，而這兩項(xiàng)測(cè)試不僅快速（一般20-30分鐘），而且價(jià)格相對(duì)便宜。2、D3UltraDFA試劑的檢測(cè)原理是用熒光（FITC）標(biāo)記的單克隆抗體檢測(cè)病毒抗原，屬于直接熒光免疫法。Vircell產(chǎn)品的檢測(cè)原理是用抗原檢測(cè)抗體（IgM），使用的方法是間接免疫熒光法。雖然檢測(cè)IgM能區(qū)分出是既往感染還是急性感染，但是抗體產(chǎn)生的個(gè)體差異較大，特別是1歲以下的嬰幼兒和有免疫缺陷的人群，其抗體往往產(chǎn)生較慢。短時(shí)間內(nèi)，在體內(nèi)抗體不足的情況下，可能會(huì)出現(xiàn)假陰性，從而錯(cuò)過了治療的最佳時(shí)期。甲型流感病毒其表面抗原變異較快，而人體往往不能及時(shí)產(chǎn)生針對(duì)新毒株的抗體，這時(shí)也會(huì)造成假陰性。間接免疫熒光法會(huì)增加非特異性反應(yīng)的幾率。表2、Vircell與D3UltraDFA試劑對(duì)比VircellD3UltraDFA檢測(cè)項(xiàng)目9項(xiàng)呼吸道病原體，其中包含在我國(guó)發(fā)病率很低的Q熱立克次氏體只檢測(cè)呼吸道病毒，降低患者的看病成本，患者更易接受檢測(cè)原理需要體內(nèi)產(chǎn)生抗體后才能檢測(cè)出病原體，如果抗體產(chǎn)生較慢或者無抗體產(chǎn)生會(huì)有假陰性只要有病原體存在即可檢測(cè)，可在發(fā)病早期進(jìn)行快速診斷臨床意義*作為回顧性診斷，對(duì)病例的早期診斷意義不大可用于疾病早期診斷，對(duì)患者的治療有重大意義檢測(cè)靈敏度不能很好地檢測(cè)變異的病毒將多種抗體進(jìn)行組合，能更好地應(yīng)對(duì)變異的病毒，在多項(xiàng)檢測(cè)項(xiàng)目中靈敏度達(dá)到100%檢測(cè)方法間接免疫熒光法，二抗的使用會(huì)增加非特異性反應(yīng)直接免疫熒光法，特異性提高實(shí)驗(yàn)步驟二抗的使用讓實(shí)驗(yàn)步驟變得較為繁瑣一步染色，不易交叉污染*備注：引用自《流行性感冒診斷與治療指南（2011年版）》附錄1七種病毒檢測(cè)的臨床意義流感病毒侵入呼吸道，經(jīng)1-2天的潛伏期，感染者即可出現(xiàn)流感癥狀。病毒在上皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，很少入血，但可釋放內(nèi)毒素樣物質(zhì)入血，引起全身中毒癥狀：發(fā)熱、頭痛、全身酸痛、疲乏無力、白細(xì)胞數(shù)下降等。幼兒或年老體弱病人感染流感病毒易繼發(fā)細(xì)菌感染，如合并肺炎等，病死率高。嬰幼兒特別是2-6個(gè)月的嬰兒對(duì)RSV特別敏感，常引起較為嚴(yán)重的呼吸道疾病，如細(xì)支氣管炎、肺炎等，患兒常出現(xiàn)呼吸暫停，氣管或細(xì)支氣管壞死物與粘液、纖維蛋白等結(jié)集在一起，極易阻塞患兒的呼吸道，嚴(yán)重者造成死亡。在我國(guó)RSV還是引發(fā)流行性喘憋性肺炎的主要病原，可引起嬰幼兒尤其是新生兒較高的死率。腺病毒主要引起呼吸道感染，癥狀有急性發(fā)燒、咽炎、扁桃體炎等。腺病毒肺炎約占兒童期肺炎的10%，多由腺病毒3、7型引起；嬰幼兒腺病毒肺炎的病死率為8%-10%。除呼吸道疾病外，腺病毒亦可引起其他疾病，如流行性角膜炎、出血性結(jié)膜炎、急性濾泡性結(jié)膜炎等。腺病毒與嬰幼兒胃腸道疾病也有可能相關(guān)，包括闌尾炎、急性胃腸炎，有時(shí)可引起腦炎和腦膜炎、出血性膀胱炎等。副流感病毒是引起小兒急性呼吸道感染的常見病因，僅次于RSV。副流感1、2型是哮喘的主要病因，以2-4歲兒童中最為嚴(yán)重。副流感3型，亦可引起哮喘，但主要易引起嬰幼兒支氣管炎、肺炎，并以1歲以內(nèi)的嬰兒較為嚴(yán)重。病毒及其對(duì)應(yīng)抗病毒藥病毒種類抗病毒藥物流感病毒金剛烷乙胺、瑞樂沙、奧司他韋（達(dá)菲）呼吸道合胞病毒利巴韋林噴霧劑副流感病毒病情嚴(yán)重者可使用利巴韋林腺病毒沒有專門的抗病毒藥物，主要采取支持療法

附錄2實(shí)驗(yàn)室所需設(shè)備清單（試劑盒中不含）此列表中的器材和試劑是實(shí)驗(yàn)所必需的，但是未包含在試劑盒中，需要單獨(dú)購(gòu)買。器材和試劑規(guī)格1鼻咽拭子建議使用DHI配套鼻咽拭子2載玻片約70mmX20mm3蓋玻片約50mmX20mm4生物安全柜2級(jí)5恒溫培養(yǎng)箱35oC-37oC6離心機(jī)管式7熒光顯微鏡可以看FITC（490/520nm），總200倍光學(xué)變焦8燒杯多種，用于洗玻片9量筒1L（配置洗液）10帶蓋瓶1L（儲(chǔ)存稀釋洗液）11加樣槍和槍頭多種12丙酮純度100%13普通PBS溶液0.01M(Na2HPO4,KH2PO4)，pH7.414去離子水15乳膠手套16鑷子

附錄3進(jìn)口熒光顯微鏡參數(shù)生產(chǎn)廠商DigitalBio產(chǎn)地韓國(guó)電源AC100-240V，50-60HzCPUAMD