hplc法同時(shí)測(cè)定杜仲皮中4種有效成分

杜仲子牙又稱四葉樹(shù)，是中國(guó)特有的中藥。它被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)樹(shù)種。杜仲具有調(diào)節(jié)血壓血脂、降低血糖、補(bǔ)肝益腎、抗毒抑菌等藥理作用。杜仲的主要化學(xué)成分有木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、黃酮類、多糖、氨基酸等有機(jī)化合物,其中京尼平苷酸和京尼平苷屬環(huán)烯醚萜類化合物,是由植物中臭蟻二醛衍生而來(lái)的一大類天然產(chǎn)物,具有保肝利膽、抗腫瘤、降低血壓的功效;松脂醇二葡萄糖苷屬木脂素類化合物,是一類在生物體內(nèi)由雙分子苯丙素生物聚合而成的化合物,具有降血壓的功效,且降壓作用持續(xù)、平穩(wěn)、無(wú)不良反應(yīng);綠原酸屬苯丙素類化合物,是形成木脂素的先導(dǎo)化合物,抑菌活性強(qiáng)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)杜仲藥材活性成分分析檢測(cè)研究報(bào)道較多,但是大部分文獻(xiàn)根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年規(guī)定,偏重于測(cè)定杜仲葉中綠原酸或杜仲皮中松脂醇二葡萄糖苷量?，F(xiàn)代植物化學(xué)研究表明不同活性成分在杜仲葉、皮分布差異較大,為更好地評(píng)價(jià)與開(kāi)發(fā)我國(guó)杜仲藥材資源,使其天然活性成分在藥品、健康制品應(yīng)用領(lǐng)域得到充分的發(fā)揮和利用。本實(shí)驗(yàn)以杜仲皮為研究對(duì)象,建立HPLC法同時(shí)測(cè)定杜仲皮中木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類三大類化合物京尼平苷酸、京尼平苷、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷4種主要組分,為有效控制杜仲藥材的質(zhì)量提供準(zhǔn)確、迅速的檢測(cè)方法,并為后續(xù)產(chǎn)業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)建立提供依據(jù)。1設(shè)備和材料1.1色譜數(shù)據(jù)工作站高效液相色譜儀(島津LC—10ATVP),LCsolution色譜數(shù)據(jù)工作站;4504MP電子天平(萬(wàn)分之一);超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司,KQ3200B型,功率為150W);純水機(jī)(ThermoFisher公司,DIamondTII型)。1.2試劑:乙腈或稱乙腈京尼平苷酸、京尼平苷、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品購(gòu)于北京北化恒信生物技術(shù)有限公司(質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%);乙腈為色譜純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),其余試劑均為分析純(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司),水為超純水;不同產(chǎn)地樣品購(gòu)于江西樟樹(shù)藥材市場(chǎng),經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院朱衛(wèi)平副教授鑒定為杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥樹(shù)皮,60℃烘干、粉碎過(guò)20目篩備用。2方法和結(jié)果2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取京尼平苷酸、京尼平苷、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品置棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,得到京尼平苷酸0.041mg/mL、京尼平苷0.037mg/mL、綠原酸0.048mg/mL、松脂醇二葡萄糖苷0.036mg/mL混合對(duì)照品溶液,4℃保存?zhèn)溆谩?.2供試品溶液的制備準(zhǔn)確稱取杜仲皮藥粉1.0g置50mL錐形瓶中,加入25mL60%甲醇超聲提取40min,冷卻定容至50mL,搖勻過(guò)0.45μm濾膜,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。2.3流動(dòng)相a-1%磷酸溶液b的制備色譜柱:KromasilC18柱(200mm×4.6mm,5μm);柱溫30℃;進(jìn)樣量5μL;流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脫,0~7min,7%A;7~35min,14%A;35~45min,15%A。體積流量1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)235nm,此色譜條件下對(duì)照品與供試品分析圖譜見(jiàn)圖1。2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取對(duì)照品混合溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5μL,按照“2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析,測(cè)定峰面積。以各對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)(X),其峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到京尼平苷酸的回歸方程為Y=52270X+5037,r=0.9999,線性范圍0.1025~0.5125μg;京尼平苷的回歸方程為Y=44531X+3329.4,r=0.9999,線性范圍0.0925~0.4625μg;綠原酸的回歸方程為Y=76580X+7788.8,r=0.9996,線性范圍0.1200~0.6000μg;松脂醇二葡萄糖苷的回歸方程為Y=27193X+9373.7,r=0.9998,線性范圍0.0900~0.4500μg。2.5京尼平苷酸、京尼平苷、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷峰面積精密吸取同一混合對(duì)照品溶液5μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄京尼平苷酸、京尼平苷、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷峰面積,RSD分別為1.70%、1.13%、1.95%、1.67%。2.6抗起酸含量的測(cè)定精密稱取同一批次杜仲皮樣品5份,每份1.0g,依“2.2”項(xiàng)制備得供試品溶液,測(cè)定京尼平苷酸、京尼平苷、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷的峰面積,計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù),RSD分別為1.17%、1.45%、2.04%、1.54%。2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液5μL,分別于0、2、4、8、12h進(jìn)樣,測(cè)定京尼平苷酸、京尼平苷、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷的峰面積,其RSD分別為1.51%、1.85%、1.31%、1.30%,結(jié)果表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.8加樣回收率試驗(yàn)精密稱取1.0g已測(cè)定的杜仲皮藥粉3份,置于3個(gè)50mL錐形燒瓶中,分別加入混合對(duì)照品溶液1、2、3mL,按“2.2”項(xiàng)制備供試品溶液,測(cè)定,計(jì)算加樣回收率。京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸的加樣回收率分別為98.97%、98.71%、100.44%、98.20%,RSD分別為1.54%、1.30%、1.13%、0.76%。2.9測(cè)定總糖含量的測(cè)定取7批不同產(chǎn)地杜仲皮樣品,依“2.2”項(xiàng)制備得供試品溶液,在“2.3”項(xiàng)色譜條件下對(duì)京尼平苷酸、京尼平苷、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷進(jìn)行分析,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。3色譜分離效率的測(cè)定本實(shí)驗(yàn)在流動(dòng)相選擇過(guò)程中發(fā)現(xiàn)純水分離時(shí)色譜峰拖尾嚴(yán)重,影響分析準(zhǔn)確性,加入酸性溶劑后峰形得以改善,通過(guò)添加甲酸與磷酸后對(duì)比,發(fā)現(xiàn)0.1%磷酸可提高杜仲有效成分的保留,因此確定0.1%磷酸作為水相的添加劑以改善色譜分離效果。京尼平苷酸、京尼平苷在240nm,綠原酸在235nm和325nm,松脂醇二葡萄糖苷在227nm波長(zhǎng)下有較強(qiáng)的紫外吸收,低于230nm波長(zhǎng)時(shí),京尼平苷酸、京尼平苷、綠原酸吸收峰小,分析準(zhǔn)確性較差,但松脂醇二葡萄糖苷在波長(zhǎng)大于240nm后基本無(wú)吸收峰,本實(shí)驗(yàn)選擇235nm的紫外條件下,穩(wěn)定快,干