太平洋牡蠣酶解過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化

牡蠣是世界上最重要的養(yǎng)殖種類，也是中國四大主要養(yǎng)殖種類之一。2010年世界牡蠣年產(chǎn)量為459萬t。而太平洋牡蠣(Crassostreagigas)因其產(chǎn)量高、效益好近幾年來受到廣泛的關(guān)注。近年來,應(yīng)用蛋白酶酶解牡蠣制備水解產(chǎn)物受到廣泛關(guān)注。牡蠣經(jīng)過酶解后,不僅其營養(yǎng)物質(zhì)更容易被人體吸收并且還具有降血壓和抗氧化等多種生理功能。但是牡蠣本身所具有的腥味以及酶解過程中產(chǎn)生的異味嚴重影響了牡蠣酶解物的應(yīng)用。研究表明,造成牡蠣酶解液不良風味的主要原因是酶解過程中牡蠣脂質(zhì)的氧化降解以及蛋白質(zhì)降解。牡蠣經(jīng)過均質(zhì)處理后,其肌肉組織受到機械損傷,不飽和脂肪酸暴露在空氣中,經(jīng)過蛋白酶酶解的作用,其質(zhì)構(gòu)不斷變松散,導(dǎo)致脂肪與空氣中的氧氣接觸面積增大,加劇了氧化裂解。同時,蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物氨基酸又同脂肪氧化產(chǎn)物共存,加強了酸敗作用,引起牡蠣酶解液色、香、味的不斷惡化。Yarnpakdee等在羅非魚酶解過程中加入復(fù)合抗氧化劑(水溶性維生素E(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid,Trolox)和乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)),得到風味良好的酶解液。生姜是傳統(tǒng)中藥材和香辛調(diào)味料,其提取物具有抗氧化、降血糖等多種生理活性。姜中另一有效成分——姜精油,不僅可以貢獻出愉快的風味,還可以掩蓋不良風味。黃冬香等曾報道用鮮姜汁酶解羅非魚肉,得到風味良好的魚肉酶解液。但是用生姜改善牡蠣酶解過程中的風味還未見報道。劉慧、葉盛權(quán)等利用活性碳、β-環(huán)糊精、酵母發(fā)酵等多種方法對牡蠣酶解液進行風味改善,但是這些方法會導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的部分損失。此外,目前關(guān)于牡蠣在酶解過程中異味產(chǎn)生的機理及改善方法的研究報道也比較少。因此,本實驗利用感官、化學指標以及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)探討牡蠣酶解過程中揮發(fā)性成分變化的情況,在此基礎(chǔ)上探究姜汁對牡蠣酶解過程中脂肪氧化的抑制作用以及對牡蠣酶解液的風味改善作用。從而為改善牡蠣酶解液風味以及研發(fā)優(yōu)質(zhì)牡蠣制品提供一定的理論基礎(chǔ)和實驗數(shù)據(jù)。1材料和方法1.1蛋白質(zhì)和氨基酸太平洋牡蠣購于青島南山市場,軟體組織平均質(zhì)量(15±5)g;生姜產(chǎn)于山東濰坊。堿性內(nèi)切蛋白酶Alcalase2.4L(90U/mg)、胰蛋白酶(100U/mg)、風味蛋白酶(15U/mg)丹麥諾維信公司;丙二醛、甘氨酸、VE標準品美國西格瑪公司。其他化學試劑均為分析純。1.2u3000儀器DS-1高速組織搗碎機上海標本模型廠;7230型分光光度計上海精密科學儀器有限公司;GL-G-Ⅱ立式冷凍離心機上海安亭科學儀器廠;DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器鄭州長城科工貿(mào)有限公司;GC6890-5973MSD氣相色譜-質(zhì)譜儀(gaschromatographmassspectrometer,GC-MS)美國安捷倫公司;SPME萃取頭(30~50μm聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯(polydimethylsiloxane/divinylbenzenecoating,PDMS/DVB)美國Supelco公司。1.3方法1.3.1蛋白質(zhì)添加量選擇牡蠣肉洗凈后打漿,固定料液比為1∶3(m/V),酸堿調(diào)節(jié)pH值至7.2,每克蛋白質(zhì)分別添加1500UAlcalase2.4L、胰蛋白酶、風味蛋白酶(3種酶活力比為2∶1∶1),55℃酶解2h后置于沸水中滅酶10min。于5000r/min離心10min后取上清液。1.3.2牡蠣勻漿酶解結(jié)果生姜洗凈后切塊,添加質(zhì)量分數(shù)為50%的水打漿。過濾后取濾液待用。酶解之前加入質(zhì)量分數(shù)為2%的濾液于牡蠣勻漿中與其一起酶解。本實驗姜汁中姜辣素含量為13.57mg/mL,總酚含量為73mg/100mL。DPPH自由基清除力為2.64mmol/LTrolox,還原力為5.03mmol/LTrolox。1.3.3快速測定方法測定總成分配的吸光度取1mL樣品與1mL茚三酮溶液(含質(zhì)量分數(shù)為0.5%茚三酮與0.3%D-果糖)混合后置于沸水中加熱10min,再加入5mL95%的乙醇,混勻后于570nm波長處測定其吸光度,同時以甘氨酸做標準曲線。1.3.4測定硫代比妥酸t(yī)hiobalbitoriccacsubhance，nbs的值參照Srinivasan等的方法。1.3.5感官評價學習將30g樣品裝在100mL錐形瓶中,密封平衡30min。10個感官評定員(5男5女),23~25歲之間,系統(tǒng)學習過感官評定課程,有豐富的感官評定經(jīng)驗。采用0~10分制評定氣味強度,0分最弱,10分為最強,最后得分取平均值。在訓練階段,感官評定員在嗅聞樣品后經(jīng)過討論,決定使用與牡蠣風味相關(guān)的感官描述詞匯。1.3.6gc-ms分析條件頂空固相微萃取(solidphasemicro-extraction,SPME)條件:將8mL樣品裝在SPME專用瓶中,60℃萃取30min。萃取結(jié)束后立即將萃取針插入進樣口(250℃)中解析4min。萃取頭在首次使用時需250℃老化1h。色譜條件:HP-5毛細管色譜柱(5%苯基,95%聚二甲基硅氧烷):(30m×0.32mm,0.25μm);載氣為高純氦氣(99.999%),流速1.0mL/min;不分流進樣,進樣口溫度:250℃;柱溫:初溫40℃恒溫3min,以6℃/min的速率升至200℃,再以10℃/min升至250℃,保持10min。質(zhì)譜條件:電離源為EI,離子阱溫度150℃,GC-MS傳輸線溫度250℃,質(zhì)量掃描范圍33~300,EI電子能量為70eV。利用AgilentG1701MSDProductivityChemStation增強型數(shù)據(jù)分析工作站NIST05aLibraries標準譜庫自動檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù),選擇匹配度大于80(滿分100)作為鑒定結(jié)果。用峰面積歸一化法確定物質(zhì)的相對含量。1.3.7牡蠣酶解液對樣品風味的貢獻某一種物質(zhì)是否對風味產(chǎn)生很大影響不僅要看其濃度還要分析其閾值,即揮發(fā)性化合物對于樣品總體風味的貢獻由其在風味體系中質(zhì)量濃度和闊值共同決定的。因此,本實驗通過計算化合物的相對氣味活度值(ralativeodouractivevalue,ROAV)的方法來評價該物質(zhì)對樣品總體風味的貢獻。計算見下式。式中:Cri、Ti分別是各化合物的相對含量和相應(yīng)的感覺閾值;Cmax、Tmax是對總體風味貢獻最大的組分相對含量和相應(yīng)的感覺閾值。所有的組分均滿足0<ROAVi<100,且ROAVi值越大的組分對樣品總體風味的貢獻越大。ROAV>1的風味化合物認為是所分析樣品的主體風味成分。由圖1可知,經(jīng)過感官人員的評定,與新鮮牡蠣相比,牡蠣酶解液腥味、哈喇味顯著增加;青草味顯著減弱(P<0.01);果香味在酶解前后變化不顯著(P>0.05)。這說明牡蠣經(jīng)過酶解后風味變差。馮金曉等研究發(fā)現(xiàn),牡蠣酶解液隨酶解時間的延長,腥味變重,風味變差。2.1.2牡蠣液的風味成分酶解前后的揮發(fā)性氣體成分如表1所示,經(jīng)過GC-MS以及NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索分析,酶解前的牡蠣液有35種揮發(fā)性物質(zhì),酶解后牡蠣液有42種。主要包含醛類、酮類、醇類、酯類、烴類、酸類以及雜環(huán)類等物質(zhì)。為了更方便的分析揮發(fā)性氣體成分的變化,計算檢測到的每種揮發(fā)性物質(zhì)的ROAV值,并將ROAV值>1的物質(zhì)按照從大到小的順序進行排列(表2),新鮮牡蠣液的主體風味成分主要有:1-辛烯-3-醇、(E)-2-壬烯醛、2-乙基呋喃、2,3-辛二酮、辛醛等。主要呈現(xiàn)出青草味、黃瓜味、腥味以及蘑菇味。這與顧聆琳、劉慧等研究新鮮牡蠣肉的揮發(fā)性成分大致相同,但是劉輝等對新鮮牡蠣肌肉中的揮發(fā)性物質(zhì)進行分析的結(jié)果表明,1-庚烯-3-醇、綠葉醇、肉豆蔻酸等化合物含量比較豐富,這與本研究結(jié)果略有不同。分析原因可能是原料來源、品種以及儲存的方式不同。酶解后牡蠣液的主體風味成分為:2-壬烯醛、異戊醛、二甲基硫醚、1-辛烯-3-醇、辛醛、壬醛、2-乙基呋喃等。主要呈現(xiàn)出油脂氧化的哈喇味、腥味、貝肉香以及蘑菇香氣等,這也與感官評定結(jié)果一致。而鄧焉容等認為吡嗪類、芳香醇類以及羥基呋喃等物質(zhì)是牡蠣酶解液的主要風味組成成分。這可能是由于原料的差異或者是酶的種類以及酶解條件不同。醛類是對酶解前后牡蠣風味影響最大的物質(zhì),醛類的閾值很低,很低的濃度即可產(chǎn)生很濃的風味,對牡蠣液的風味影響顯著。酶解前醛類物質(zhì)相對含量為23.54%,酶解后增加到36.9%,其中,2-壬烯醛的風味特征為肉香、蘑菇香,酶解后含量增大,是影響酶解后牡蠣液風味最大的成分。酶解前后牡蠣液的主體風味成分中都含有辛醛、壬醛、庚醛、戊醛,相對含量分別從酶解前的0.8%、0.98%、1.64%、3.4%,增加到酶解后的2.5%、1.6%、2.3%、6.8%。這些直鏈飽和醛、烯醛和二烯醛是亞油酸酯和亞麻酸酯氫過氧化物的降解產(chǎn)物,是各種氧化、刺激風味的主要來源,造成酶解液中不良風味的產(chǎn)生。一般飽和醇類物質(zhì)的閾值很高,對氣味的貢獻不顯著,而不飽和醇則有較低的閾值。醇類物質(zhì)含量由酶解前的19.43%下降到酶解后的13.41%,主要醇類為1-辛烯-3-醇,對酶解前的氣味貢獻顯著,ROAV值為100。1-辛烯-3-醇是脂肪氧化酶作用于花生四烯酸的降解產(chǎn)物,具有蘑菇香、青香、蔬菜香以及油膩的氣味,酶解前其含量為9.88%,經(jīng)過酶解含量降低到3.83%。酮類物質(zhì)含量也比較多,僅次于醛類。其相對含量由新鮮牡蠣的21.72%降低到酶解后的14.2%。新鮮牡蠣中主要的酮類物質(zhì)為:苯乙酮(14.83%)、2,3-辛二酮(4.45%)等,而酶解后含量分別為9.42%和2.21%。2,3-己二酮是酶解之后出現(xiàn)的物質(zhì),新鮮牡蠣中的含量較少。酮類化合物來自于不飽和脂肪酸的熱氧化降解、氨基酸降解或微生物的氧化作用。一般來說,酮類物質(zhì)具有甜的花香和果香風味,如:2,3-辛二酮、2-壬酮、苯乙酮對牡蠣酶解前后的愉快風味有所貢獻,但是酶解液中含量減少。呋喃類化合物大都具有很強的肉香味以及極低的香氣閾值,主要是糖分解和美拉德反應(yīng)的生成物。在酶解后呋喃類物質(zhì)相對含量增加了44.34%,其中2-戊基呋喃是酶解液中主要風味成分,其相對含量由酶解前的2.12%增加到酶解后的6.03%。該化合物是一種典型的油脂氧化產(chǎn)物,具有豆香、果香、青香及類似蔬菜的香味。二甲基硫醚是海洋生物腐爛后所散發(fā)出的一種氣體,具有刺激的洋蔥大蒜等臭味,也是海洋腥臭味的主要來源。酶解液中相對含量增加至1.74%,其貢獻值也增大。2.2姜汁是酶分解過程中的一種異味2.2.1姜汁對牡蠣酶解過程中氨基氮含量的影響由圖2可知,通過對比未加姜汁的酶解液與加入姜汁的酶解液可以發(fā)現(xiàn),兩者氨基氮含量始終無顯著性差異(P>0.05),說明姜汁的加入不影響牡蠣酶解過程中氨基氮的生成。2.2.2不同抗氧化產(chǎn)物的tbars對牡蠣酶解液風味的影響Siddaiah等發(fā)現(xiàn),脂肪氧化指標TBARS與風味感官評分呈正相關(guān),因此通過測定脂肪氧化產(chǎn)物TBARS來研究姜對牡蠣酶解液的風味改善作用。由圖3可知,與其他兩組相比,添加姜汁組在酶解過程中抑制氧化效果顯著(P<0.05)。另外,添加姜汁組的TBARS值在酶解過程中沒有顯著性增加(P>0.05),說明姜汁對抑制酶解過程中脂質(zhì)氧化有很好的效果。2.2.3姜酶解液添加量的測定加姜后牡蠣酶解液風味變化情況如圖4所示,牡蠣加姜酶解有助于酶解液風味的改善。與未加姜酶解液相比,其腥味及哈喇味顯著減少(P<0.05),令人愉快的水果氣味顯著增多(P<0.05),而青草香及肉香則變化不明顯。姜汁特有的清香濃郁風味,較能令人接受。2.2.4使用使用淮山汁和汁中的抗氧化成分對牡蠣酶解過程脂質(zhì)氧化裂解的影響經(jīng)過比較加姜酶解液與未加姜酶解液的揮發(fā)性氣體成分(表1),可以看出加姜酶解的牡蠣液中脂質(zhì)氧化裂解產(chǎn)生的不愉快氣味的物質(zhì),如:乙醛、(E)-2-戊烯醛、(Z)-4-庚烯醛、壬醛、2,3-辛二酮、1-辛烯-3-醇未被檢測出,異戊醛,己醛、(E)-2-己烯醛等物質(zhì)的相對含量分別減少了81.02%、33.28%、54.39%。另外,添加姜汁酶解的牡蠣液中檢測到較多新的令人愉快的揮發(fā)性物質(zhì),如β-月桂烯(3.02%)、6-甲基-5-庚烯-2-酮(9.25%)、對甲基苯乙酮(0.14%)、2-丁酮(0.93%)等。對加姜汁酶解液進行主成分分析(表2),可以看出加姜牡蠣液的主體風味成分有2-壬烯醛、對甲基苯乙酮、異戊醛、2-乙基呋喃