固定化微生物載體材料的制備及其在麥汁發(fā)酵中的應(yīng)用

固定化技術(shù)是在20世紀(jì)中期發(fā)展起來的一種新生物技術(shù)。它的發(fā)展可以分為兩個(gè)階段。第一個(gè)是固定化酶階段，始于20世紀(jì)50年代，第二個(gè)是固定化細(xì)胞階段，誕生于20世紀(jì)70年代中期，但后者的應(yīng)用范圍和發(fā)展前景遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了第一個(gè)。1983年，在美國(guó)著名的雜志encyme和美國(guó)國(guó)立科學(xué)院首次提出了“固定化酶”的概念?！肮潭ɑ锎呋瘎币辉~于1983年首次出現(xiàn)在美國(guó)著名雜志enhyme和微型生物技術(shù)研究所。所謂固定化生物催化劑是一種使用化學(xué)或物理方法將游離生物催化劑固定在有限的空間區(qū)域內(nèi)，以保持活性并重復(fù)使用的新型生物技術(shù)。因此，它具有小型高效、穩(wěn)定、重復(fù)和連續(xù)使用、易連續(xù)反應(yīng)和自動(dòng)控制等優(yōu)點(diǎn)，提高了產(chǎn)品的純度和過程效率，克服了環(huán)境敏感、性質(zhì)不穩(wěn)定、易迷失或死亡等缺點(diǎn)。同時(shí)，固定化生物技術(shù)可以充分利用化工過程中的非均勻相氧化技術(shù)優(yōu)勢(shì)。海藻酸鈉和殼聚糖均是無毒、生物相容性好、可生物降解的天然高分子材料,且具有一定的保健功能.海藻酸鈉-殼聚糖已被應(yīng)用于藥物控制釋放、固定化生物催化劑、細(xì)胞培養(yǎng)及微反應(yīng)器、人體器官和基因運(yùn)載工具以及分離介質(zhì)等領(lǐng)域,效果良好,應(yīng)用前景十分廣闊.作者以殼聚糖-海藻酸鈉復(fù)合水凝膠固定化啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae),并對(duì)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、固化時(shí)間、覆膜時(shí)間等因素對(duì)復(fù)合水凝膠的硬度和固定化啤酒酵母發(fā)酵降糖的影響進(jìn)行研究,以期為殼聚糖-海藻酸鈉復(fù)合水凝膠在啤酒釀造方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ).1材料和方法1.1試劑及儀器海藻酸鈉(SA)成都市聯(lián)合化工試劑研究所生產(chǎn);殼聚糖(生化試劑,DD≥90%),上海伯奧生物科技有限公司生產(chǎn);冰醋酸(AR),天津市博迪化工有限公司生產(chǎn);氯化鈣(AR),天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);氯化鈉(AR),汕頭市光華化學(xué)廠生產(chǎn);啤酒酵母,廣州微生物研究所生產(chǎn);麥芽汁,珠江啤酒廠生產(chǎn),瓊脂(生化試劑),汕頭市水產(chǎn)品綜合加工廠生產(chǎn).QTS-25TextureAnalyser,CNSFARNELL生產(chǎn);2WAJ阿貝折光儀,上光實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn).1.2測(cè)試方法1.2.1殼聚糖的制備將酵母菌懸液與除菌海藻酸鈉溶液混合均勻,緩慢滴入體積分?jǐn)?shù)4%的氯化鈣溶液中即成白色球形顆粒,并緩慢攪拌使其懸浮在氯化鈣溶液中,此時(shí)鈉離子與鈣離子相互置換,海藻酸鈣膠珠逐漸硬化定型(球形顆粒),繼續(xù)在氯化鈣溶液中固化2h,然后在體積分?jǐn)?shù)為0.5%的殼聚糖溶液中覆膜30min,經(jīng)生理鹽水洗滌3次后,置冰箱備用.1.2.2外觀發(fā)酵度測(cè)定發(fā)酵度是指麥汁中浸出物被酵母消耗部分與原麥汁浸出物總量之比.發(fā)酵度分為外觀發(fā)酵度、真正發(fā)酵度和最終發(fā)酵度.外觀發(fā)酵度是發(fā)酵過程中外觀糖度降低的百分?jǐn)?shù),是以糖度表實(shí)測(cè)外觀殘留糖度而計(jì)算的發(fā)酵度.由于測(cè)量時(shí)未考慮酒精、CO2的影響,所以比實(shí)際糖度要低.其測(cè)得發(fā)酵度比實(shí)際發(fā)酵度要高.本試驗(yàn)用2WAJ阿貝折光儀測(cè)定發(fā)酵前后麥芽汁的糖度,并按下式計(jì)算其外觀發(fā)酵度:外觀發(fā)醉度(％)=原麥汁糖度?發(fā)酵后麥汁糖度原麥汁糖度×100%(％)=原麥汁糖度-發(fā)酵后麥汁糖度原麥汁糖度×100%外觀發(fā)酵度越高,表明發(fā)酵過程中外觀糖度降低越大,啤酒酵母的發(fā)酵能力越強(qiáng),因而它是發(fā)酵管理的一項(xiàng)重要內(nèi)容,也是酵母降糖及啤酒質(zhì)量控制必要措施之一.1.2.3凝膠硬度測(cè)定將QTS-25TextureAnalyser上直徑為10mm的圓柱形探頭置于凝膠表面,以15mm/min的速度下降,當(dāng)圓柱形探頭下降6mm時(shí)測(cè)得凝膠硬度,單位為克.2結(jié)果與討論2.1固定化載的硬度研究2.1.1海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)載體硬度的影響分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%、1.5%、2%、2.5%和3%的海藻酸鈉制備5個(gè)樣品,研究海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化載體硬度的影響,結(jié)果見圖1.由圖1可以看出,隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,載體的硬度呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì).其可能是由于隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,單位體積內(nèi)海藻酸鈉分子數(shù)增多,其長(zhǎng)鏈分子堆砌在一起更容易發(fā)生鏈的纏結(jié),勾結(jié)點(diǎn)可看成是可移動(dòng)的交聯(lián)點(diǎn),海藻酸鈉分子內(nèi)、分子間也更易形成氫鍵,而氫鍵的締合則類似于交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的交聯(lián)點(diǎn),交聯(lián)點(diǎn)增多則結(jié)構(gòu)致密,從而導(dǎo)致海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大時(shí)其硬度也隨之增大.海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般不小于1.0%,否則會(huì)因聚陰離子溶液的粘度太低而在下滴過程中嚴(yán)重變形,凝膠在氯化鈣溶液中難于形成球形顆粒.2.1.2固化時(shí)間的影響分別在固化時(shí)間為0.5h、1h、1.5h、2h和3h時(shí)制備5個(gè)樣品,研究固化時(shí)間對(duì)載體硬度的影響,結(jié)果(圖2)表明,隨著固化時(shí)間的增加,載體的硬度也隨之增大.這是由于固化時(shí)間越長(zhǎng),海藻酸鈉與氯化鈣的反應(yīng)就越完全,形成的海藻酸鈣膠珠就越致密.因此用殼聚糖溶液覆膜后的海藻酸鈣-殼聚糖固定化載體具有更好機(jī)械強(qiáng)度.2.1.3殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)載體硬度的影響分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.3%、0.5%、0.8%和1.0%的殼聚糖制備5個(gè)樣品,觀察殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)載體硬度的影響,結(jié)果見圖3.由圖3可以看出,載體的硬度隨著殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而不斷增大.當(dāng)殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由0.3%增加到0.5%時(shí),載體硬度增加的速率較快,而質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.5%～1.0%時(shí),載體硬度增加的速率較為緩慢.這是由于隨殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,載體外膜厚度就越大,而殼聚糖本身具有一定的硬度,從而使得載體硬度隨著殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增大;但當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到一定值時(shí),載體外膜厚度增加速率變慢,因而其硬度增加也隨之趨緩.2.1.4覆膜時(shí)間對(duì)載體硬度的影響分別用覆膜時(shí)間為5min、10min、15min、20min和30min制備5個(gè)樣品,研究覆膜時(shí)間對(duì)載體硬度的影響,結(jié)果如圖4所示.從圖4可以看出,載體硬度隨著覆膜時(shí)間的增加而不斷增大.這是由于覆膜時(shí)間越長(zhǎng),海藻酸鈣與殼聚糖之間的正負(fù)電荷的吸附就越完全,同時(shí)殼聚糖覆在載體表面的厚度就越大,從而載體硬度也就越大.2.2固定化器的應(yīng)用研究2.2.1海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)外觀發(fā)酵度的影響按照固定化載體制備方法,在其他條件不變的情況下,包埋一定質(zhì)量濃度的酵母菌液,改變海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù),觀察海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)外觀發(fā)酵度的影響,結(jié)果如圖5所示.從圖5可知,當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí),載體降糖能力最強(qiáng),外觀發(fā)酵度達(dá)最大.原因可能是當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí),形成的載體較海藻酸鈉高時(shí)透明,且較疏松,固定微生物的能力也較弱,部分酵母從固定化載體中泄露出來成為游離的啤酒酵母,游離的啤酒酵母因直接和麥汁中的可發(fā)酵性糖接觸,所以麥汁糖度下降最快,其外觀發(fā)酵度也最大.2.2.2固化時(shí)間對(duì)載體外觀發(fā)酵度的影響按照固定化微囊制備方法,在其他條件不變的情況下,包埋一定質(zhì)量濃度的酵母菌液,改變固化時(shí)間,觀察固化時(shí)間對(duì)外觀發(fā)酵度的影響,結(jié)果如圖6所示.從圖6中可以看出,固化時(shí)間為3h時(shí),載體外觀發(fā)酵度最大.這是由于海藻酸鈉與鈣鹽作用后,分子中鈉離子與鈣離子進(jìn)行交換,生成海藻酸鈣.由于Ca2+的交聯(lián)作用,隨著固化時(shí)間的增加分子間相互作用力增強(qiáng),使線性分子彼此相互連接形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),酵母在其中活動(dòng)空間增加,繁殖加快,降糖速率也隨之加快.2.2.3殼聚糖含量對(duì)降糖效果的影響按照固定化微囊制備方法,在其他條件不變的情況下,包埋一定質(zhì)量濃度的酵母菌液,改變殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù),研究殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)外觀發(fā)酵度的影響,結(jié)果(圖7)表明,殼聚糖溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)雖然相差不大,但覆膜后降糖能力卻有明顯區(qū)別.當(dāng)殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%時(shí),外觀發(fā)酵度最大.本試驗(yàn)采用的殼聚糖脫乙酰度大于90%,即殼聚糖分子鏈上氨基的數(shù)量占90%以上,而乙酰氨基數(shù)量在10%以下.由于殼聚糖分子中存在大量的氨基,氨基易發(fā)生電離而帶正電荷,可與海藻酸鈣分子中大量帶負(fù)電荷的羧基通過正負(fù)電荷吸引形成聚電解質(zhì)膜.當(dāng)殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%時(shí),形成的殼聚糖—海藻酸鈣聚電解質(zhì)膜能使海藻酸鈣—?dú)ぞ厶枪潭ɑd體具有較合適的強(qiáng)度和較好的滲透擴(kuò)散性能,因而其外觀發(fā)酵度最大.2.2.4覆膜時(shí)間和覆膜厚度對(duì)啤酒外觀發(fā)酵度的影響包埋一定質(zhì)量濃度的酵母菌液,改變覆膜時(shí)間,觀察覆膜時(shí)間對(duì)外觀發(fā)酵度的影響,結(jié)果(圖8)表明,不同覆膜時(shí)間處理間其外觀發(fā)酵度相差并不是很大.當(dāng)覆膜時(shí)間為10min時(shí),其外觀發(fā)酵度最大.這是因?yàn)殡S覆膜時(shí)間的延長(zhǎng),載體外的殼聚糖膜越厚,滲透擴(kuò)散性能下降,載體中游離的啤酒酵母與可發(fā)酵性糖接觸較少.因而外觀發(fā)酵度不高.所以膜并不是越厚越有利于發(fā)酵,適當(dāng)?shù)哪ず穸炔庞欣跔I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的進(jìn)入以及代謝物質(zhì)的排出.3聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)載體硬度的影響海藻酸鈉與殼聚糖可形成復(fù)合水凝膠,它可作為一種載體材料用于固定啤酒酵母,并