高通量藥物篩選的檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

1高通量藥物篩選技術(shù)在目前的藥物合成研究領(lǐng)域，結(jié)合化學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)技術(shù)的結(jié)合，顯著加速了候選藥物的合成速度，顯著增加了合成化合物的數(shù)量。除了中藥含有的巨大天然化合物庫(kù)外，藥物活性篩選的速度和規(guī)模已成為制約藥物開(kāi)發(fā)的瓶頸。因此，高流量藥物篩選（hts）的研究變得越來(lái)越重要[1.3]。高通量藥物篩選技術(shù)是以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ),采用自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過(guò)程,以靈敏快速的檢測(cè)儀器采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),再通過(guò)計(jì)算機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理.由于高通量藥物篩選模型中分子、細(xì)胞水平上的相互作用,只有采用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法才能以可視化的形式反映出來(lái),因此高通量的檢測(cè)方法是實(shí)現(xiàn)HTS的關(guān)鍵技術(shù)之一.本文綜述了HTS中現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展,主要涵蓋光學(xué)分析、色譜分析、熱分析、電化學(xué)分析、質(zhì)譜、核磁共振等分析檢測(cè)技術(shù).2光學(xué)檢測(cè)信號(hào)在HTS中最常見(jiàn)的篩選方式是以微孔板作為反應(yīng)載體,將樣品和生物活性分子均勻分布,形成混合狀態(tài)的均相篩選法(homogeneousscreeningassay).這種篩選方式如果要實(shí)現(xiàn)原位檢測(cè),則篩選系統(tǒng)本身必須含有理想的檢測(cè)信號(hào),用于評(píng)價(jià)樣品的作用強(qiáng)弱,而且檢測(cè)系統(tǒng)能與微孔板反應(yīng)載體兼容,易于實(shí)現(xiàn)篩選操作的自動(dòng)化.光學(xué)檢測(cè)信號(hào)在這方面體現(xiàn)出了特殊優(yōu)勢(shì),以微孔板為基礎(chǔ)的高通量光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)可以追溯到最初的酶標(biāo)儀,現(xiàn)在的高通量檢測(cè)儀器兼容的微孔板密度已經(jīng)由最初的96孔增加到384孔,部分儀器甚至可以使用1536孔板進(jìn)行測(cè)量,大幅度提高了篩選通量.光學(xué)檢測(cè)技術(shù)也由單一的紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)擴(kuò)大到化學(xué)發(fā)光檢測(cè)、熒光檢測(cè)和各種光學(xué)傳感技術(shù),為高通量檢測(cè)開(kāi)辟了較廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域.2.1血管緊張素1轉(zhuǎn)換抑制劑紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)技術(shù)是酶抑制劑的高通量藥物篩選中應(yīng)用最為廣泛的檢測(cè)手段之一,主要檢測(cè)形式是通過(guò)酶促反應(yīng)產(chǎn)物的光吸收強(qiáng)度來(lái)測(cè)定酶活力,進(jìn)而評(píng)價(jià)不同抑制劑的抑制程度.柳軍等建立了篩選降糖藥物的糖原磷酸化酶(GPa)抑制劑高通量篩選模型,依據(jù)磷酸化酶水解糖原后生成的磷酸根與鉬酸銨/孔雀綠反應(yīng)的產(chǎn)物在655nm處有特異性吸收的性質(zhì).Jimsheena等建立的血管緊張素1轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑HTS方法,其檢測(cè)原理是根據(jù)ACE酶解底物后生成的馬尿酸在410nm處有強(qiáng)吸收的這一特性.2.2化學(xué)發(fā)光檢測(cè)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)也在酶抑制劑篩選中得到了應(yīng)用,Guardigli等通過(guò)酶促反應(yīng)產(chǎn)物硫膽堿的化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度來(lái)評(píng)價(jià)乙酰膽堿酯酶(AChE)的活力,并據(jù)此原理建立了乙酰膽堿酯酶抑制劑的HTS方法.與紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)技術(shù)相比,化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)具有高靈敏度的優(yōu)勢(shì),最近Aljofan等又將其成功地應(yīng)用于抗新型腦炎病毒藥物的高通量篩選中.2.3熒光標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)手段最為豐富多樣者當(dāng)屬熒光檢測(cè)技術(shù),除常規(guī)的熒光強(qiáng)度檢測(cè)(fluorimetry)外,基于熒光猝滅現(xiàn)象的熒光猝滅檢測(cè)(fluorescencequenching,FQ)、測(cè)量熒光分子受偏振光激發(fā)后發(fā)射光偏振程度的熒光偏振檢測(cè)(fluorescencepolarization,FP)、測(cè)量由熒光受體向熒光受體能量轉(zhuǎn)移引起光強(qiáng)度變化的熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)和均相時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)(homogeneoustime-resolvedfluorescenceresonanceenergytransfer,HTRF)等多種熒光檢測(cè)技術(shù)均在高通量篩選中得到了應(yīng)用,熒光檢測(cè)技術(shù)適用范圍也從酶抑制劑篩選拓展到以受體、離子通道、細(xì)胞為靶點(diǎn)的高通量藥物篩選.熒光檢測(cè)技術(shù)的缺陷在于可產(chǎn)生熒光的化合物僅為少數(shù),對(duì)于缺乏熒光活性的篩選系統(tǒng)一般采用將熒光活性分子與篩選系統(tǒng)內(nèi)分子鍵合標(biāo)記,作為探針?lè)从硺悠返淖饔们闆r.這種熒光標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)靈活多樣,極大地?cái)U(kuò)展了熒光檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用范圍,使其成為HTS中應(yīng)用最為活躍的檢測(cè)手段之一.2005年由國(guó)家重大科技專項(xiàng)“新藥篩選平臺(tái)研究”課題組建立的針對(duì)心血管系統(tǒng)藥物靶點(diǎn)的HTS平臺(tái),就是以熒光標(biāo)記的熒光偏振檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)構(gòu)建的.但值得指出的是生物活性分子鍵合熒光標(biāo)記分子后,也可能產(chǎn)生構(gòu)象變化、活性結(jié)合位點(diǎn)的覆蓋和空間阻礙等不利因素,造成生理活性被改變.比較典型的一個(gè)例子是:Howitz等根據(jù)熒光標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果認(rèn)為白藜蘆醇等多酚抗氧化劑能有效激活去乙?；窼IRT1,但隨后Kaeberlein等和Borra等的研究分別證實(shí)這種激活作用實(shí)際上依賴于檢測(cè)所用熒光標(biāo)記試劑.因此,研究者應(yīng)對(duì)標(biāo)記技術(shù)有可能造成HTS中出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性篩選結(jié)果的問(wèn)題有足夠的重視.2.4熒光標(biāo)記檢測(cè)除了熒光標(biāo)記技術(shù),放射性同位素標(biāo)記技術(shù)也在一些藥物篩選模型上得到了應(yīng)用,但該技術(shù)需要在檢測(cè)前將游離的配體分子過(guò)濾分離,篩選通量受到一定限制,多結(jié)合一種稱為鄰近閃爍分析(scintillationproximityassay,SPA)的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行應(yīng)用.SPA技術(shù)主要采用一種鍵合有受體分子的熒光微球,當(dāng)同位素標(biāo)記的配體與受體分子結(jié)合時(shí),放射性同位素分子與熒光微球之間的距離足夠近,此時(shí)放射性同位素發(fā)射出的β粒子能夠激發(fā)微球發(fā)射熒光,而游離的同位素標(biāo)記配體與熒光微球距離較遠(yuǎn),不能激發(fā)熒光,因此無(wú)需分離游離的和結(jié)合的標(biāo)記配體,只要通過(guò)檢測(cè)篩選系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度變化就可以實(shí)現(xiàn)受體的親和力篩選.SPA技術(shù)靈敏度高,特異性強(qiáng),已被廣泛應(yīng)用于以酶、蛋白受體為靶點(diǎn)的HTS中.由于放射性同位素的使用可能造成環(huán)境污染,近年來(lái)出現(xiàn)以光敏感劑取代放射性同位素激發(fā)熒光的Alphascreen篩選法,迅速在酶抑制劑及以細(xì)胞、RNA為靶點(diǎn)的高通量藥物篩選中得到了廣泛應(yīng)用.這些技術(shù)在檢測(cè)原理上都是以熒光檢測(cè)為基礎(chǔ),在應(yīng)用上也有頗多類(lèi)似之處,比如HTRF法實(shí)際上可視為以鑭系元素作為光敏感劑的Alphascreen篩選法,因此廣義而言只是熒光標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用拓展.2.5光學(xué)傳感檢測(cè)鑒于光學(xué)標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)存在著一些固有的缺陷,近年來(lái)具有非標(biāo)記檢測(cè)特征的光學(xué)傳感器技術(shù)迅速成為高通量篩選檢測(cè)技術(shù)研究中的“寵兒”.目前應(yīng)用于藥物篩選的光學(xué)傳感器多是通過(guò)包被在傳感器件敏感膜表面(sensorsubstrate)的生物識(shí)別分子,與篩選分子特異性結(jié)合時(shí)引起傳感器件的光電物理特性(如光強(qiáng),折射率或電阻等)的變化,再通過(guò)適當(dāng)?shù)膿Q能器轉(zhuǎn)換為檢測(cè)信號(hào),從而定性、定量地檢測(cè)樣品的作用情況(圖1).光學(xué)傳感檢測(cè)技術(shù)特有的非標(biāo)記優(yōu)點(diǎn),使得其中的代表性技術(shù)如表面等離子體共振(surfaceplasmonresonance,SPR)技術(shù)和反射光干涉(reflectometricinterferencespectroscopy,RIFS)技術(shù)已在高通量篩選結(jié)果驗(yàn)證中發(fā)揮了重要作用,但與傳統(tǒng)的光學(xué)檢測(cè)器相比,光學(xué)傳感器技術(shù)的儀器檢測(cè)成本較高,限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用.比如傳感器件用作能量轉(zhuǎn)換中介時(shí),一般需要高純度的光學(xué)材料,如硅、光導(dǎo)纖維,并經(jīng)過(guò)光刻、介質(zhì)沉積、等離子蝕刻等程序進(jìn)行修飾,價(jià)格不菲;同時(shí)由于傳感器件又作為篩選體系的高通量載體,這使得光學(xué)傳感器篩選通量的成本異常高昂,因此Cunningham等開(kāi)始研究易于增加篩選通量的傳感器件如光子晶體(photoniccrystal,PC),也有研究者轉(zhuǎn)向價(jià)格較為低廉的基于光化學(xué)特性的傳感器.3光譜檢測(cè)技術(shù)3.1親和色譜篩選技術(shù)現(xiàn)代色譜法是藥物研究中應(yīng)用最為活躍的分離分析技術(shù)之一,在藥品質(zhì)量控制、新藥研發(fā)、生物醫(yī)學(xué)分析等領(lǐng)域占據(jù)舉足輕重的地位.在種類(lèi)繁多的現(xiàn)代色譜法分支中,有一種利用生物分子間親和力進(jìn)行分離的液相色譜技術(shù),稱之為親和色譜法(affinitychromatography,AC).該技術(shù)最初主要用于分離純化蛋白質(zhì)等生物大分子,隨著藥物篩選技術(shù)研究的深入,親和色譜法在高通量篩選領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值開(kāi)始受到重視.高通量篩選中的親和色譜技術(shù),常將生物靶分子固定于基質(zhì)作為固定相,在色譜分離過(guò)程時(shí)樣品與受體的特異性結(jié)合能力決定了樣品的保留,因此通過(guò)保留時(shí)間可以直接獲得樣品與受體親和力的信息,從而實(shí)現(xiàn)藥物的活性篩選.最早應(yīng)用于藥物活性篩選當(dāng)屬模擬生物膜結(jié)構(gòu)的磷脂膜色譜(immobilizedartificialmembranechromatography,IAMC),該法將磷脂作為色譜固定相,用于篩選藥物的親脂性.相對(duì)于其他生物活性分子,磷脂性質(zhì)穩(wěn)定,色譜制備較為方便,因此IAMC已經(jīng)作為藥物親脂性篩選的有力手段而廣受認(rèn)同,IAMC柱也已有商品化出售.另外一種研究較多的是HSA蛋白質(zhì)柱(immobilizedhumanserumalbuminchromatography),HSA柱較早主要應(yīng)用于手性化合物的分離,近年來(lái)開(kāi)始用于篩選藥物與蛋白的親合力大小,如Mallik等應(yīng)用HSA柱研究了維拉帕米兩種對(duì)映異構(gòu)體與人血漿蛋白結(jié)合力的差異.隨著色譜技術(shù)的發(fā)展,親合色譜篩選技術(shù)的研究熱點(diǎn)也層出不窮.首先是固定化的生物活性分子種類(lèi)不斷增加,紛紛涌現(xiàn)出以酶、受體蛋白、離子通道為作用靶點(diǎn)的各種色譜篩選模型.其次,色譜分離的檢測(cè)手段日益多樣化,特別是研究者將高靈敏度的質(zhì)譜檢測(cè)器與親和色譜技術(shù)聯(lián)用,拓展了AC篩選技術(shù)的應(yīng)用范圍.此外,隨著親和色譜分離機(jī)制的研究深入,也出現(xiàn)了新的親和色譜篩選方式,如Schiel等以色譜峰的峰寬來(lái)研究小分子藥物與蛋白的結(jié)合速率.而對(duì)于國(guó)內(nèi)研究者而言,應(yīng)用親和色譜進(jìn)行中藥活性成分篩選無(wú)疑是目前最為熱門(mén)的研究領(lǐng)域之一.應(yīng)該說(shuō),從篩選通量看,親和色譜法可能很難達(dá)到光學(xué)檢測(cè)技術(shù)的規(guī)模,但這種篩選方式的最大優(yōu)勢(shì)在于集分離與受體親和力篩選于一體,將其應(yīng)用于中藥活性成分篩選正是恰如其分.3.2毛細(xì)管電泳前沿分析近年來(lái),與親和色譜法類(lèi)似的親合毛細(xì)管電泳法(affinitycapillaryelectrophoresis,ACE)在高通量藥物篩選應(yīng)用中開(kāi)始嶄露頭角,Lewis等應(yīng)用ACE法快速篩選了44000多個(gè)小分子化合物與新的抗微生物蛋白靶點(diǎn)的親合力,Pascoe等應(yīng)用類(lèi)似的囊泡電動(dòng)毛細(xì)管電泳法(vesicularelectrokineticchromatography,VEKC)篩選藥物的親脂性.電泳法分離快速、高效的特點(diǎn)是ACE在高通量藥物篩選應(yīng)用中的突出優(yōu)勢(shì)之一,但是ACE采用常規(guī)的紫外檢測(cè)時(shí)靈敏度較低,多需要與質(zhì)譜檢測(cè)器聯(lián)用.親和毛細(xì)管電泳法中供篩選的生物活性分子一般添加在緩沖液中,雖然與親和色譜法中的受體固定化方法相比應(yīng)用較為簡(jiǎn)便,但是在運(yùn)行過(guò)程中蛋白消耗量較大,從這一角度看毛細(xì)管電泳前沿分析(frontalanalysis-capillaryelectrophoresis,FACE)可能更適合于藥物與受體的親和力篩選.FACE以常規(guī)的緩沖溶液為分離介質(zhì),進(jìn)樣樣品為平衡的藥物與受體混合物,運(yùn)行過(guò)程中游離的藥物與受體分離,經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)形成平臺(tái)峰,利用峰高可以計(jì)算游離藥物的濃度,進(jìn)而求得藥物與受體的親和力大小(圖2).FACE提供了一種與AC、ACE完全不同的篩選方式,該法測(cè)定平衡狀態(tài)下的親和力也與人體實(shí)際生理環(huán)境更為接近,是一種極具特色的受體親和力篩選方法.FACE目前已用于藥物與血漿蛋白親和力的篩選,隨著與芯片電泳、質(zhì)譜等聯(lián)用技術(shù)的不斷發(fā)展成熟,毛細(xì)管電泳前沿分析技術(shù)必將在高通量藥物篩選中發(fā)揮更為重要的作用.4質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)質(zhì)譜法是藥物研究中應(yīng)用最為廣泛的分析技術(shù)之一,特別是以電噴霧離子源(electrosprayionization,ESI)和基質(zhì)輔助激光解析離子源(matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI)為代表的現(xiàn)代質(zhì)譜離子源的出現(xiàn),極大地?cái)U(kuò)展了質(zhì)譜法的分析對(duì)象和應(yīng)用領(lǐng)域,使其成為藥物標(biāo)靶發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)的重要技術(shù)手段.應(yīng)用質(zhì)譜法進(jìn)行藥物篩選可以同時(shí)檢測(cè)剩余底物量和生成產(chǎn)物量,因而比光學(xué)檢測(cè)技術(shù)能夠提供更多的樣品作用信息.如Deng等應(yīng)用質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了MurC酶抑制劑的篩選,方法靈敏度高、線性范圍寬,與傳統(tǒng)的比色法相比避免了大量的假陽(yáng)性篩選結(jié)果.正是具備這些優(yōu)點(diǎn),質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)在以酶、RNA、受體蛋白為靶點(diǎn)的高通量藥物篩選中得到了應(yīng)用.4.1質(zhì)譜檢測(cè)設(shè)備在HTS中應(yīng)用最多的還是ESI離子源及與之類(lèi)似的APCI離子源,但這類(lèi)離子源難以兼容高離子強(qiáng)度、含不揮發(fā)性鹽的溶液,而藥物篩選體系本身就是一個(gè)含有大量緩沖鹽的系統(tǒng),因此質(zhì)譜直接流動(dòng)注射分析(flowinjectionanalysis,FIA)技術(shù)并不適合于高通量藥物篩選,樣品檢測(cè)前需經(jīng)過(guò)分離步驟以除去干擾組分.高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)是目前在生物樣本分析中最為常用的一種分離分析技術(shù),不過(guò)由于色譜分離所需時(shí)間一般都需要數(shù)分鐘,不利于提高篩選通量;即使以較短的HPLC分析時(shí)間2min/次為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算,篩選384孔樣品仍超過(guò)12h.為了提高篩選通量,Roddy等應(yīng)用Waters公司生產(chǎn)的四個(gè)電噴霧離子源并行于同一質(zhì)譜儀的多重離子源裝置(MUX)和Gilson公司推出的含有多個(gè)自動(dòng)進(jìn)樣器的MultipleProbe進(jìn)樣裝置,四臺(tái)液相色譜儀連續(xù)不斷進(jìn)樣分析,篩選384孔酶抑制劑樣品的時(shí)間在2h左右.這種高通量篩選模式依賴于多重離子源裝置,不僅儀器價(jià)格昂貴,而且質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度相應(yīng)降低且交叉污染較難避免.在其他生物樣品前處理技術(shù)中,固相萃取技術(shù)(solid-phaseextraction,SPE)所需樣品量少,便于自動(dòng)化操作,可以大大縮短樣品制備時(shí)間,處理后的樣品通過(guò)流動(dòng)注射直接進(jìn)入質(zhì)譜分析,對(duì)于質(zhì)譜法的高通量篩選檢測(cè)較為有利.Ozbal等和Forbes等應(yīng)用SPE前處理技術(shù)分別建立了乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制劑和磷脂酰絲氨酸脫羧酶(PSD)抑制劑的質(zhì)譜HTS模型.Maxine等應(yīng)用BioTrove推出的帶有快速自動(dòng)進(jìn)樣器的RapidFire質(zhì)譜儀,與96孔板固相萃取自動(dòng)化裝置聯(lián)用后8h內(nèi)可以篩選的酶抑制劑樣本超過(guò)5000個(gè),如采用384孔板篩選通量還可以進(jìn)一步提高.Quercia應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行了蛋白激酶B(PKB/AKT1)抑制劑的高通量篩選,并與傳統(tǒng)的鄰近閃爍分析技術(shù)作了比較,兩者的篩選結(jié)果較為接近,驗(yàn)證了這種質(zhì)譜檢測(cè)方式在HTS中的可行性.雖然SPE-FIA-MS檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)可在一定程度上滿足HTS的要求,但為了避免交叉污染固相萃取柱無(wú)法多次使用,再加上本身的價(jià)格和高通量篩選必備的自動(dòng)化裝置更進(jìn)一步增加了檢測(cè)成本,這是目前制約其廣泛應(yīng)用的主要障礙之一.4.2maldi-ms/ms方法從檢測(cè)方式上看MALDI離子源檢測(cè)無(wú)需分離程序,與微孔板兼容性更好,分析速度和篩選通量較ESI離子源更易提高,最近在HTS中也開(kāi)始得到應(yīng)用.由于MALDI檢測(cè)的基質(zhì)組分會(huì)對(duì)低分子量段的質(zhì)譜檢測(cè)產(chǎn)生干擾,不利于檢測(cè)小分子底物,Jason等將MALDI離子源與選擇性很高的三重四極桿質(zhì)量分析器(MS/MS)聯(lián)用后可以有效消除這種干擾.隨后Hofner等將MALDI-MS/MS技術(shù)與96微孔板聯(lián)用,成功用于甘露糖(α1,3)糖蛋白β-1,2-N乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(mGAT1)靶點(diǎn)的高通量親和力篩選(圖3),該法通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記物NO711含量反映酶活力,獲得酶促反應(yīng)曲線進(jìn)而計(jì)算樣品與靶點(diǎn)的親和力大小.而Greis等應(yīng)用傳統(tǒng)的飛行時(shí)間質(zhì)量分析器(TOF)同樣實(shí)現(xiàn)了酶抑制劑的高通量篩選.這些HTS模型在8h內(nèi)的樣品篩選數(shù)目都在9000個(gè)左右,篩選通量要顯著高于ESI離子源,但是MALDI離子源的定量重現(xiàn)性較差,應(yīng)用該檢測(cè)技術(shù)的HTS模型的篩選質(zhì)量仍有待進(jìn)一步評(píng)價(jià).5膜片鉗的離子通道研究電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)作為現(xiàn)代分析技術(shù)的重要分支,在藥物分析領(lǐng)域有著較為廣泛的應(yīng)用.近年來(lái),依托膜片鉗技術(shù)(patch-clamptechnique)的電化學(xué)檢測(cè)手段在以離子通道為靶點(diǎn)的高通量藥物篩選中展現(xiàn)出了獨(dú)特優(yōu)勢(shì).細(xì)胞膜上的離子通道是一類(lèi)重要的藥物篩選靶點(diǎn),作用于離子通道的藥物在很多重大疾病的治療中發(fā)揮著重要作用.雖然與疾病相關(guān)的離子通道不斷被成功克隆,但是對(duì)離子通道特別是以電壓門(mén)控離子通道為靶點(diǎn)的高通量篩選一直受限于合適檢測(cè)手段的缺乏.由于離子通道的功能主要體現(xiàn)在控制細(xì)胞內(nèi)外離子的進(jìn)出,因此研究離子通道功能的最佳方法就是依托膜片鉗技術(shù)直接測(cè)定通過(guò)離子通道的電流,其他的檢測(cè)手段如熒光標(biāo)記技術(shù)只是間接反映這種功能的變化.膜片鉗技術(shù)一般將玻璃電化學(xué)微電極尖端吸附于細(xì)胞膜,在微電極尖端的邊緣與細(xì)胞膜之間形成高阻抗封接,記錄通過(guò)離子通道的微小離子電流,從而研究其功能.膜片鉗技術(shù)信息含量大、分辨率高,被認(rèn)為是離子通道分析的“金標(biāo)準(zhǔn)”.但是該技術(shù)每次只能對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行操作,且操作步驟繁瑣復(fù)雜,因此對(duì)高通量膜片鉗技術(shù)的開(kāi)發(fā)成為研究者必然的選擇.目前研究較多的是以帶有微孔的平面電極板代替?zhèn)鹘y(tǒng)玻璃微電極的平板膜片鉗技術(shù)(planarpatchclamptechnique).平面電極板一般采用硅、玻璃、塑料等絕緣材料為載體,在載體上構(gòu)建1~2μm的微孔作為電極,微孔上方作為細(xì)胞外室,下方作為細(xì)胞內(nèi)室,并輸入細(xì)胞內(nèi)液流體,再在細(xì)胞外室插入金屬絲構(gòu)成完整的平板膜片電極,測(cè)定時(shí)將細(xì)胞引導(dǎo)到微孔上與細(xì)胞膜形成高阻抗封接,這樣就可以簡(jiǎn)便快捷地實(shí)現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞同時(shí)測(cè)定(圖4).平板膜片鉗技術(shù)的發(fā)展為離子通道活性的大規(guī)模平行篩選提供了可能,因此各大公司紛紛推出以該技術(shù)為基礎(chǔ)的測(cè)量?jī)x器.較早的商品化儀器是MolecularDevices公司生產(chǎn)的Ionworks系統(tǒng),近來(lái)Karczewski等應(yīng)用該系統(tǒng)成功建立了以電壓門(mén)控的Kv1.5鉀離子通道為靶點(diǎn)的篩選模型;Farre等將Nation公司生產(chǎn)的Port-a-Patch系統(tǒng)應(yīng)用于HEK細(xì)胞鈉離子通道的研究,顯著提升了篩選通量.Tao等使用AxonInstrument公司生產(chǎn)的PatchXpress技術(shù)平臺(tái)研究小分子化合物對(duì)hERG鉀離子通道的藥理作用,在保證測(cè)量可靠性的同時(shí)體現(xiàn)了較高的篩選通量.應(yīng)用這些檢測(cè)儀器,平板膜片鉗技術(shù)的篩選通量可達(dá)到384孔樣品/h,已經(jīng)可在一定程度上滿足離子通道的HTS要求.然而目前得到應(yīng)用的篩選模型成功率普遍在70%左右,而且檢測(cè)儀器昂貴,特別是實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)的平面電極板價(jià)格不菲且難以循環(huán)使用,這無(wú)疑限制了該技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用.當(dāng)然針對(duì)上述不足,研究者也仍然在不斷發(fā)展、改善該項(xiàng)檢測(cè)技術(shù),我們有理由相信以電化學(xué)檢測(cè)為基礎(chǔ)的膜片鉗電極陣列技術(shù)將在離子通道的HTS中發(fā)揮更為重要的作用.6itc法測(cè)定吉布斯自由能的應(yīng)用各種熱分析技術(shù)是藥物熔點(diǎn)測(cè)定、純度檢查、多晶型分析、藥物中結(jié)晶水與吸附水確認(rèn)等新藥研究項(xiàng)目中不可或缺的重要技術(shù).其中差示掃描量熱法(differentialscanningcalorimetry,DSC)是通過(guò)測(cè)量熱量變化與溫度、時(shí)間之間關(guān)系的一種技術(shù).以該技術(shù)原理為基礎(chǔ)的等溫滴定量熱法(isothermaltitrationcalorimetry,ITC)目前已經(jīng)在分子識(shí)別、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-小分子相互作用等生物熱動(dòng)學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用.藥物分子與生物活性分子如蛋白受體、酶之間的相互作用,與上述生化反應(yīng)一樣往往伴隨著熱量的變化,因此將等溫滴定量熱法作為檢測(cè)手段進(jìn)行高通量藥物篩選日益受到研究者的重視.等溫滴定量熱法的工作原理與常規(guī)差示掃描量熱法相似,只是增加了一個(gè)配體滴定模板(ligandtitrant)(圖5).應(yīng)用ITC法研究藥物分子與受體間相互作用時(shí),常采用一定量的受體分子作為被滴定物,而一定濃度的藥物分子作為滴定配體勻速地滴加到受體分子所處的隔熱罩中,同時(shí)測(cè)量滴定過(guò)程中樣品池(samplecell)和參比池(referencecell)熱量差的變化,獲得滴定熱量差隨時(shí)間的變化曲線圖.結(jié)合根據(jù)單點(diǎn)結(jié)合模型所建立的數(shù)學(xué)表達(dá)式對(duì)該變化曲線進(jìn)行非線性擬合,可求算得到藥物分子與受體之間的親和力常數(shù).在上述實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)處理模型基礎(chǔ)上,ITC法在以核苷酸、蛋白受體、酶為靶點(diǎn)的藥物快速篩選中得到了一定應(yīng)用.由于ITC法不僅能夠測(cè)得體系吉布斯自由能的變化,還能夠同時(shí)測(cè)得體系中焓變和熵變對(duì)吉布斯自由能變化的數(shù)據(jù),因此在測(cè)定親和力常數(shù)之外,ITC法可以提供更多關(guān)于結(jié)合反應(yīng)特征的信息.Carbonell等應(yīng)用ITC法研究了他汀類(lèi)降血脂藥物與HMG-CoA還原酶受體靶點(diǎn)之間的結(jié)合性質(zhì),根據(jù)不同藥物結(jié)合反應(yīng)時(shí)焓變和熵變對(duì)吉布斯自由能變化的不同貢獻(xiàn),認(rèn)為結(jié)合過(guò)程中體系的焓變反映了藥物與受體靶點(diǎn)的特異性結(jié)合力,與藥效相關(guān);而熵變反映了藥物的非特異性結(jié)合力,與藥物的副作用相關(guān).由于熱效應(yīng)是各種生物化學(xué)反應(yīng)的本質(zhì)特征之一,因此ITC法檢測(cè)的應(yīng)用范圍較廣;而通過(guò)ITC法檢測(cè)可以研究藥物與受體靶點(diǎn)結(jié)合的特異性,這更是其他檢測(cè)技術(shù)較難具備的特殊優(yōu)勢(shì),凸顯了ITC法在高通量藥物篩選中誘人的應(yīng)用前景.ITC法在HTS中應(yīng)用的主要障礙在于篩選通量的不足,即使采用最新商品化的MicroCal微型ITC儀進(jìn)行藥物篩選,一天的篩選容量也僅為384孔樣品,與其他檢測(cè)技術(shù)尚有不小差距.加上ITC法進(jìn)行藥物篩選時(shí)所需靶點(diǎn)分子的用量較大,因此目前ITC法僅在藥物確證篩選方面發(fā)揮了一定作用,要作為HTS的常規(guī)檢測(cè)技術(shù)仍需要在儀器微型化方面取得進(jìn)一步的突破.7核磁共振檢測(cè)技術(shù)核磁共振是指一種核磁矩不為零的原子核,在外磁場(chǎng)的作用下,核自旋能級(jí)發(fā)生塞曼分裂,共振吸收特定頻率的射頻輻射的物理過(guò)程.自上個(gè)世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象以來(lái),核磁共振技術(shù)逐漸成為解析有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的有力手段.近年來(lái)隨著高場(chǎng)核磁共振儀的問(wèn)世和多維譜技術(shù)的成熟,核磁共振技術(shù)的應(yīng)用范圍也從有機(jī)小分子拓展到了生物大分子領(lǐng)域.作為目前在原子分辨率下測(cè)定溶液中生物大分子三維結(jié)構(gòu)的唯一手段,核磁共振技術(shù)在研究蛋白質(zhì)-配基相互作用方面具有特殊優(yōu)勢(shì),是新藥研發(fā)的重要研究技術(shù)之一.在先導(dǎo)化合物確證和優(yōu)化中,一般對(duì)不同藥物濃度與蛋白質(zhì)相互作用后、蛋白質(zhì)1H-15NHSQC(heteronuclearsinglequantumcoherence)譜在接近生理?xiàng)l件下鑒定或驗(yàn)證候選藥物與靶點(diǎn)親和力的大小,但對(duì)于HTS而言,費(fèi)時(shí)、昂貴的二維譜并不適合作為一種常規(guī)的檢測(cè)手段,研究者一般致力于將分析時(shí)間較短的一維核磁共振譜應(yīng)用于高通量篩選.Robert等提出將1H-NMR應(yīng)用于藥物篩選的方法,其主要原理在于通過(guò)滴加受體分子,根據(jù)不同受體濃度對(duì)于小分子化合物1H譜吸收峰強(qiáng)弱的變化,結(jié)合一定的數(shù)學(xué)處理模型計(jì)算得到親和力的大小.利用該技術(shù)測(cè)得了27個(gè)化合物與人血清白蛋白之間的受體親和力,并將其與常規(guī)手段測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了線性回歸,回歸系數(shù)達(dá)到0.81.通過(guò)不同濃度樣品與檢測(cè)信號(hào)變化的關(guān)系來(lái)測(cè)定受體親和力的大小是高通量篩選中常用的篩選形式,應(yīng)用該法時(shí)一般測(cè)量6個(gè)濃度點(diǎn)以上樣品,以便獲得穩(wěn)定的親和力常數(shù).鑒于核磁共振技術(shù)分析速度慢,且難以并行檢測(cè),無(wú)疑應(yīng)用單點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)篩選法更為現(xiàn)實(shí).單點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)篩選試驗(yàn)需要使用一種參比物作為探針?lè)肿?通過(guò)研究待測(cè)樣品對(duì)探針?lè)肿优c受體親和的競(jìng)爭(zhēng)程度來(lái)推算樣品的受體親和力,應(yīng)用核磁共振技術(shù)時(shí)這種競(jìng)爭(zhēng)程度可通過(guò)核磁共振譜中檢測(cè)信號(hào)的變化來(lái)反映.目前研究較多的一種篩選方式是Dalvit等提出的19F-NMR競(jìng)爭(zhēng)篩選法,該法通過(guò)測(cè)量待測(cè)樣品加入前后19F-NMR譜共振信號(hào)強(qiáng)度的變化來(lái)表征待測(cè)樣品對(duì)探針?lè)肿拥母?jìng)爭(zhēng)置換能力,可供檢測(cè)的靶點(diǎn)包括了絲氨酸/蘇氨酸p21活化激酶、人血清白蛋白等.這種技術(shù)關(guān)鍵是需要找到與受體有一定親和力的19F標(biāo)記探針?lè)肿?雖然目前ACD-SC(availablechemicalsdirectory-screeningcompounds)篩選化合物庫(kù)中大約12%的分子含有氟原子,但是很多情況下仍然需要專門(mén)合成這種探針?lè)肿?為提高檢測(cè)的通用性,最近研究者又轉(zhuǎn)向運(yùn)用1H-NMR競(jìng)爭(zhēng)篩選法,但是這種方式中的探針?lè)肿优c待測(cè)樣品之間的譜線往往會(huì)發(fā)生重疊,實(shí)際應(yīng)用中仍有很大的局限性.總體來(lái)看,與核磁共振技術(shù)在解析生物大分子結(jié)構(gòu)和研究其相互間作用的重要性