一測多評法在中藥質(zhì)量評價中的應(yīng)用

中藥質(zhì)量控制和評價是現(xiàn)代中醫(yī)工程的瓶頸之一。中藥多成分、多功效的作用特點,決定了單一成分或指標(biāo)評價難以表達中藥的質(zhì)量,由此多成分同步測定的質(zhì)量控制模式應(yīng)運而生。大量此類研究相繼發(fā)表在國內(nèi)外學(xué)術(shù)期刊上,甚至單味藥中同步測定成分多達26個,然而,商品化對照品的供不應(yīng)求和多指標(biāo)高昂的檢測成本限制了該模式在實際生產(chǎn)、科研和監(jiān)管領(lǐng)域的應(yīng)用?；谥兴幍幕瘜W(xué)成分多為一類或幾類相似物,各成分間存在某些內(nèi)在關(guān)系,本課題組率先提出了一測多評(quantitativeanalysisofmulti-componentsbysingle-marker,QAMS)的質(zhì)量評價方法。該方法提出以后逐漸被行業(yè)內(nèi)研究學(xué)者接受和認可,從方法的適應(yīng)范圍、方法學(xué)驗證等多方面進行了深入研究和完善,關(guān)于QAMS研究的技術(shù)指南已被簡要概述和總結(jié)?，F(xiàn)就QAMS的由來與發(fā)展、應(yīng)用可行性研究近況以及評價模式建立過程中涉及的關(guān)鍵問題進行簡要概述。1亞胺類化藥中+前藥的質(zhì)量評價QAMS的研究思路起源于內(nèi)標(biāo)法、校正因子法、主成分自身對照法以及紫外百分吸收系數(shù)法等幾個概念。內(nèi)標(biāo)法為藥物分析中經(jīng)典的分析方法,內(nèi)標(biāo)物的選擇至關(guān)重要,特別是對于成分復(fù)雜的中藥樣品而言,選擇性質(zhì)穩(wěn)定、不與所含成分發(fā)生反應(yīng)、色譜行為良好的內(nèi)標(biāo)物尤其困難;校正因子法在氣相色譜分析中較為常用,液相色譜分析中應(yīng)用相對較少,并且缺乏系統(tǒng)的方法學(xué)驗證過程;主成分自身對照法常用于西藥相關(guān)物質(zhì)的限度檢查,很少用于主要成分的準(zhǔn)確定量;紫外百分吸收系數(shù)法可以用于液相色譜定量分析,但由于HPLC分析的流動相選擇與紫外吸收分析相反,很難直接將紫外吸收分析方法中的溶劑作為高效液相分析的溶劑系統(tǒng)。QAMS借鑒上述幾種方法的研究思路,依據(jù)在一定的范圍(線性范圍)內(nèi)成分的量(質(zhì)量或濃度)與檢測器響應(yīng)成正比的原理,即W=fA,在多指標(biāo)質(zhì)量評價時,引入相對校正因子的概念,以樣品中某一典型成分(有對照品供應(yīng)者、價廉、有活性)為內(nèi)標(biāo),建立該成分與其他成分之間的相對校正因子(relativecorrectionfactor,RCF),通過RCF計算其他成分的含量。該方法首次在木通藥材中進行了技術(shù)適用性和應(yīng)用可行性探索研究,針對方法學(xué)驗證過程、方法耐用性、系統(tǒng)適用性以及如何科學(xué)合理評價計算值與實測值之間的差異進行了系統(tǒng)研究。隨后,同行學(xué)者依照該研究思路,進行了不同藥材[13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34]及成藥制劑中QAMS的可行性研究;也有研究者采用相同的思路開展相似的研究,但方法名稱不同,比如替代對照品法[38,39,40,41,42,43]、內(nèi)標(biāo)多控法、系統(tǒng)內(nèi)標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)校正法等。鑒于各研究的研究思路、技術(shù)路線基本相同或相似,故將所涉及的研究品種和化合物類別一并總結(jié)在表1,各化合物的結(jié)構(gòu)和它們之間的RCF歸納在圖1,表2。沿用QAMS的思路開展研究的中藥材及制劑達20種以上,各研究品種涉及的化學(xué)成分類別有生物堿、皂苷、黃酮、木脂素、香豆素、蒽醌、酚酸、倍半萜和單萜等,其中大部分采用高效液相-紫外檢測器開展研究,少數(shù)采用LC-MS檢測。由于結(jié)構(gòu)相似的同類成分之間紫外吸收相近,QAMS的應(yīng)用可行性研究多在同類成分之間進行,比如木通皂苷、人參皂苷、柴胡皂苷、黃芪異黃酮、大黃蒽醌等;部分為結(jié)構(gòu)母核不同的成分之間的可行性研究,如連翹中蘆丁為黃酮類,連翹酯苷A為苯乙醇苷類,連翹苷和連翹脂素為木脂素類,在4種成分的共有紫外吸收區(qū)選擇275nm進行檢測,采用QAMS和外標(biāo)法測定的含量沒有顯著性差異。在QAMS質(zhì)量評價模式中,引入了新的量值———相對校正因子RCF,由此引入了新的誤差,但從已發(fā)表的文獻分析,該方法與常規(guī)外標(biāo)法檢測的結(jié)果沒有顯著性差異,基本滿足分析誤差的要求。因此,存在對照品獲得困難或多指標(biāo)高昂檢測成本的情況下,QAMS不失為一種可行的、值得探討和推廣的檢測方法。事實上,早在2006年,《歐洲藥典》收載的銀杏標(biāo)準(zhǔn)即采用相似的檢測方法進行總成分分析,《日本藥典》中總蝦青素的含量測定、《美國藥典》穿心蓮的檢測也是如此,《中國藥典》2010年版銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)項下采用槲皮素、山柰素、異鼠李素總量乘以系數(shù)2.51進行總黃酮苷的含量計算,同時,黃連藥材標(biāo)準(zhǔn)項下小檗堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀的含量測定方法即為QAMS研究的典型實例。2中藥的多指標(biāo)質(zhì)量控制和評價模式盡管QAMS在克服對照品短缺和節(jié)省高昂檢測成本方面顯示了突出優(yōu)勢和良好應(yīng)用前景,使中藥的多指標(biāo)質(zhì)量控制和評價模式應(yīng)用于生產(chǎn)實際成為可能,然而不可否認,該評價模式建立的過程中,幾個關(guān)鍵性的問題必須進行深入研究和探討。2.1對照品供應(yīng)特性從表2所列的檢測指標(biāo)看,指標(biāo)成分選擇依據(jù)待測樣品中藥理作用基本明確的有效成分,或者是公認的與藥材(成藥)臨床功效具有相關(guān)性的指標(biāo)成分或?qū)俪煞?選作參照物的成分具備商品化的價廉易得的對照品供應(yīng)特性。比如吳茱萸中選擇吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯,黃芩中選擇黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素,人參選擇人參皂苷類成分。但部分研究中其他檢測指標(biāo)的選擇對于“不易得到或制備難度大或不穩(wěn)定”的特性考慮欠缺,比如以芍藥苷對芍藥內(nèi)酯苷的RCF計算白芍中的芍藥內(nèi)酯苷的含量,以芍藥苷為參比,計算柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和甘草酸的含量等。若開展QAMS研究的指標(biāo)選擇不能體現(xiàn)“解決對照品缺乏供應(yīng)或者降低檢測成本”的根本原則,則研究就偏離了QAMS的基本思想。2.2重組因素對rcf波動影響的模擬在QAMS建立的過程中,所有引起檢測器響應(yīng)值變化的因素均有可能引起RCF的波動,從而在計算值和實測值之間引入誤差。因此,保證建立的RCF具有良好的重現(xiàn)性,是QAMS方法分析結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵。2.2.1色譜檢測條件除了檢測過程中的系統(tǒng)誤差和人為誤差,分析儀器硬件引起的誤差應(yīng)該被考慮。大多數(shù)QAMS研究采用不同的分析儀器系統(tǒng)進行檢測、計算平均RCF,間接地考察了流量精度、波長的穩(wěn)定性等因素對RCF的影響,涉及的儀器品牌和型號主要為Waters,Agilent2家公司不同型號的高效液相色譜儀,個別為奧泰公司色譜儀。對于色譜檢測條件而言,不同的固定相種類、流動相組成、檢測器的類型是考慮的主要因素。固定相的種類主要集中在Agilent,Phenomenex等10余家色譜柱生產(chǎn)廠家的反相碳十八鍵合硅膠柱,對固定相的粒度、色譜柱的內(nèi)徑、長短缺乏系統(tǒng)的考察,見表2。流動相的組成可以顯著影響待測色譜峰的分離度和峰參數(shù),引起RCF的偏差,不過該偏差可以通過有效的改善色譜系統(tǒng),優(yōu)化色譜條件而降至最低。2.2.2檢測波長的選擇目前,QAMS研究中常用的檢測器為紫外檢測器,少數(shù)研究中RCF的計算基于通用型質(zhì)譜檢測器、UV-CAD和紫外-電化學(xué)發(fā)光聯(lián)用檢測器等得到的響應(yīng)值。對于紫外檢測器,實驗中根據(jù)結(jié)構(gòu)特性選擇合適的檢測波長至關(guān)重要。若檢測指標(biāo)成分為結(jié)構(gòu)母核相同的類似物,各檢測成分的紫外吸收相同(響應(yīng)值相同),檢測波長選擇在最大吸收波長處即可;若檢測的為不同類別成分,參比成分和其他待測成分紫外吸收光譜不盡相同,檢測波長的選擇有2種情況:一是選擇它們之間共有的吸收波長區(qū),如蘆丁為黃酮醇類,最大吸收波長分別在255,355nm;連翹酯苷A為苯乙醇苷類,最大吸收波長在328,288nm處有肩峰;連翹苷和連翹脂素為雙環(huán)氧木脂素類,最大吸收波長分別在229,278nm,綜合3者共有的平坦吸收區(qū),最終選擇275nm作為檢測波長,計算的相對校正因子的重現(xiàn)性良好。二是根據(jù)待測成分的最大吸收波長,分別選擇相應(yīng)的檢測波長,在梯度洗脫過程中實現(xiàn)可變波長檢測。梔子中梔子苷和西紅花酸類衍生物為不同類別的化合物,前20min選擇梔子苷的最大吸收238nm,后20min選擇西紅花酸類最大吸收440nm;桂枝湯梯度檢測過程中,230nm檢測芍藥苷、250nm檢測甘草酸和280nm分別檢測甘草苷、肉桂酸、桂皮醛;四逆散梯度檢測過程中,250nm檢測芍藥苷和甘草酸,280nm檢測柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷。2.2.3正常色譜條件考察同類成分結(jié)構(gòu)及其相似(母核相同,僅有取代基的微小差異)的同系物之間最大紫外吸收相近,RCF理論上應(yīng)該接近于1,但從表2的實際測定值可以看出,部分成分之間RCF嚴(yán)重偏離1。比如以芒柄花素(50)為參比,計算的對其他3個異黃酮類成分(51~53)的RCFs;以二醇型人參皂苷Rb1(9)為參比,計算的三醇型人參皂苷類成分(4~7)的RCFs。除了結(jié)構(gòu)稍有差異,但選擇了固定檢測波長進行分析造成誤差之外,色譜峰和對照品的純度也是造成RCF嚴(yán)重偏離的可能原因。色譜峰純度在色譜條件考察過程中應(yīng)當(dāng)已經(jīng)被考慮,因而使用對照品的純度需要引起研究者的關(guān)注。QAMS研究的初衷之一是充分發(fā)揮科研工作者擁有大量單體成分的優(yōu)勢,這些缺乏商業(yè)化對照品供應(yīng)的單體成分,盡管經(jīng)過了基于波譜、光譜數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)鑒定和HPLC面積歸一化的純度檢查(純度大于98%),畢竟未經(jīng)過嚴(yán)格的純度標(biāo)定,有可能導(dǎo)致RCF建立過程中使用的自制對照品的實際純度偏低,是造成RCF嚴(yán)重偏離的可能原因之一。2.2.4質(zhì)量評價結(jié)果內(nèi)參物與待測成分之間色譜保留性質(zhì)差異較大也會引起RCF較大的偏差。比如黨參中以黨參炔苷97為參比,計算黨參苷IV98和蒼術(shù)內(nèi)酯III99的RCFs,盡管文獻報道的RCFs經(jīng)過了系統(tǒng)的方法學(xué)考察,采用RCFs計算的含量結(jié)果與實測值的貼近程度也令人滿意,但作者不建議結(jié)構(gòu)差異懸殊、色譜保留性質(zhì)差異較大的成分采用QAMS進行藥材質(zhì)量評價,RCFs在實際運用過程中會產(chǎn)生較大的誤差。若RCFs建立過程檢測指標(biāo)較多,內(nèi)參物的選擇除了滿足價廉、穩(wěn)定、易得的特性,還可采用不同的化合物分別做內(nèi)標(biāo),建立與其他成分之間的RCFs,使用不同的RCFs計算待測成分的含量,選擇計算值與實測值最貼近的RCFs和相應(yīng)的內(nèi)參物。2.3色譜峰的定位QAMS在研究階段,各待測成分均用對照品進行RCF的計算、方法學(xué)驗證等,而在實際應(yīng)用中,利用RCF計算含量,無需用到部分待測成分的對照品,勢必會遇到如何對這些成分的色譜峰進行定位的問題。中藥成分復(fù)雜,色譜圖中除待測成分色譜峰外,還存在多個其他色譜峰,因此對待測成分色譜峰的正確定位是準(zhǔn)確測定的前提。文獻中QAMS研究采用的色譜峰定位方法主要有2種:一是參考藥材典型色譜圖的基礎(chǔ)上,利用待測成分與內(nèi)參物保留時間的差值定位;二是參考藥材典型色譜圖的基礎(chǔ)上,采用待測成分與內(nèi)參物的相對保留時間比值定位。2010年版《中國藥典》收載的黃連藥材標(biāo)準(zhǔn)即采用此方法,表小檗堿、黃連堿、巴馬汀色譜峰相對于鹽酸小檗堿色譜峰的相對保留時間分別為0.71,0.78,0.91,偏差應(yīng)在規(guī)定值的±5%以內(nèi)。采用上述方法對色譜峰進行定位時,可結(jié)合化合物的紫外吸收特征,液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)給出的質(zhì)譜信息等進行輔助確認。必要時,制備含上述各待測成分的對照提取物,用于QAMS的色譜峰定位。2.4測值與總參數(shù)值的比較QAMS質(zhì)量評價模式能否最終應(yīng)用于生產(chǎn)實際,關(guān)鍵在于其計算結(jié)果的可靠程度?；诋?dāng)前的QAMS研究實例,大部分采用外標(biāo)法實測組分的絕對含量與QAMS法推算含量進行比較。采用的比較方法主要有相關(guān)系數(shù)法、夾角余弦值法、Pearson系數(shù)、配對t檢驗、直接計算兩者的偏差以及計算值與實測值的比值,即準(zhǔn)確度,其中夾角余弦值法和兩者之間偏差使用較多。QAMS計算值和外標(biāo)法實測值之間沒有顯著性差異,說明建立的RCF具有很好的重現(xiàn)性和可信度,在定量用對照品缺乏的情況下,可以通過一測多評法實現(xiàn)藥材多成分的同步含量測定。2.5rcf的簡化處理RCF的建立和實際應(yīng)用依據(jù)“深入淺出”的原則。在QAMS研究階段,充分考察不同因素對RCF的影響,并在原則上不少于3家的同行實驗室之間進行驗證,以建立相對穩(wěn)定、重復(fù)性好的RCF。確定的RCF在實際應(yīng)用時,盡可能進行簡單化處理(取整數(shù)的趨勢),而不是使用研究階段計算出的某個具體RCF數(shù)值。簡單化處理是否可行的依據(jù)是采用簡化處理過的RCF進行再驗證或再計算,使最終含量的計算值與實測值在允許的誤差范圍之內(nèi)。3應(yīng)用穩(wěn)定性研究QAMS采用僅測定一個價廉、易得的成分,實現(xiàn)多成分同步測定的模式,克服了多指標(biāo)質(zhì)量控制面臨的