6個(gè)牛品種促卵素受體基因多態(tài)性分析

牛是一個(gè)單獨(dú)的育種牛。在自然條件下，單鏈繁殖率很低，只有0.15%2.99%。為了研究牛的雙胎性狀,美國建立了高繁殖力的肉牛群,經(jīng)過10余年(1982~1993年)的選育,雙胎率由3.4%提高到28.5%,這說明雙胎具有一定的遺傳性,可以通過選育提高雙胎率。但牛的雙胎遺傳力僅為0.03,常規(guī)選育方法提高很慢。VanVleck等研究表明,產(chǎn)仔率高低受卵巢排卵數(shù)的直接影響,且雙胎與排卵的遺傳相關(guān)接近于1.00。因此,與卵巢排卵有關(guān)的基因似可作為研究雙胎的候選基因。卵巢機(jī)能受垂體促性腺激素調(diào)控,其中垂體前葉分泌的促卵泡生成素(FSH)是調(diào)控卵泡發(fā)育、成熟的主導(dǎo)激素。為此,人醫(yī)中常用FSH治療不孕,而在畜牧生產(chǎn)中用于超數(shù)排卵。研究發(fā)現(xiàn),有些多胎品種或個(gè)體血漿中的FSH濃度高于單胎品種或個(gè)體,且其垂體對促性腺激素釋放激素(GnRH)的敏感性增強(qiáng),從而促進(jìn)FSH的分泌,且卵巢對促性腺激素的反應(yīng)更加敏感(cAMP的生成量多)。然而,FSH必須與卵泡顆粒細(xì)胞膜上的促卵泡素受體(FSHR)結(jié)合,并將信息傳遞到靶細(xì)胞內(nèi),才能發(fā)揮其對卵泡的生物學(xué)功能。基因的表達(dá)是遺傳信息轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程,轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)和速率受基因5′端序列的調(diào)控,這也是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的主要方式。因此,本試驗(yàn)利用PCR-RFLP技術(shù),對6個(gè)不同牛品種的FSHR基因5′端序列(5′端側(cè)翼區(qū)和第1外顯子區(qū)域)進(jìn)行擴(kuò)增和多態(tài)性研究,以期尋找多態(tài)位點(diǎn),探求進(jìn)一步研究該基因的遺傳標(biāo)記,并分析該基因的5′端區(qū)與牛多胎性狀的可能關(guān)系。1材料和方法1.1隨機(jī)苯苯二氮本試驗(yàn)共采集了6個(gè)牛品種的176頭份血樣或凍精,其中秦川牛24頭份、中國荷斯坦牛(簡稱荷斯坦牛)32頭份,晉南牛28頭份,南陽牛28頭份,延邊牛30頭份,中國西門塔爾牛(簡稱西門塔爾牛)血樣和凍精34頭份。其中不知道是否產(chǎn)過雙胎的母牛稱為隨機(jī)母牛。用苯酚、氯仿法從凍精和血樣中提取DNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?.2引物的設(shè)計(jì)與合成由于目前尚無牛的FSHR基因5′端序列發(fā)表,因此參照Sairam和Subbarayan報(bào)道的綿羊FSHR基因5′端側(cè)翼序列和第1外顯子序列設(shè)計(jì)引物:上游引物5′AATTCATTTGTGCCAGCATCC3′,下游引物5′AGTTCGACCGCATCCCTG3′;擴(kuò)增區(qū)域包括FSHR基因5′端側(cè)翼區(qū)和第1外顯子序列。引物由北京賽百盛公司合成。PCR反應(yīng)總體積25.0μL,擴(kuò)增在PTC-200基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。1.3pcr擴(kuò)增結(jié)果在10μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2μL上樣緩沖液,經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后,用凝膠成像儀觀察擴(kuò)增結(jié)果。對達(dá)到含量標(biāo)準(zhǔn)的PCR產(chǎn)物,將剩余的15μL用限制性內(nèi)切酶PstⅠ,SinⅠ,HaeⅢ或TaqⅠ酶切。限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物工程有限公司,酶切消化按照制造商的說明進(jìn)行。1.4上電泳條件酶切產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的瓊脂糖凝膠上電泳,條件為60V電泳3~4h,EB染色。在UVIBANDV.99-凝膠成像系統(tǒng)成像,根據(jù)圖像判斷基因型。1.5遺傳距離和系統(tǒng)聚集根據(jù)Nei氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離進(jìn)行系統(tǒng)聚類。2結(jié)果與分析2.1pst,sin和hae對pcr產(chǎn)物的表達(dá)本研究設(shè)計(jì)引物的擴(kuò)增區(qū)域包括FSHR基因5′端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)818bp和第一外顯子152bp,PCR產(chǎn)物序列總長970bp。用4種內(nèi)切酶對176頭份的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單酶切,發(fā)現(xiàn)PstⅠ,SinⅠ和HaeⅢ3種內(nèi)切酶的酶切產(chǎn)物均為單態(tài)(圖略)。而TaqⅠ內(nèi)切酶的酶切產(chǎn)物出現(xiàn)了多態(tài)性(圖1)。2.2酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果電腦掃描發(fā)現(xiàn),TaqⅠ酶切位點(diǎn)(5′-T↓CGA-3′)分別位于序列的如下位置:-527→-524,-387→-384,+60→+63,+146→+149,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)TaqⅠ酶切后出現(xiàn)限制性片段的長度為446,292,140,86和6bp(AA型)。如果-387→-384位置的TaqⅠ酶切位點(diǎn)因突變而消失,則出現(xiàn)586,292,86和6bp4個(gè)片段(BB)。在AB型中,則產(chǎn)生586,446,292,140,86和6bp6個(gè)片段。由圖1可見,酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果出現(xiàn)3種不同的帶譜,按照前3個(gè)大片段的有無,判斷圖1中1,2,3,4,8為AB型,6為BB型,5,7為AA型。3種帶型的共同切點(diǎn)是-527→-524,+60→+63和+146→+149,而-387→-384酶切位點(diǎn)有多態(tài)性突變。2.36fhsr基因型頻率和頻率分布根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果,將6個(gè)牛品種FSHR基因5′端區(qū)不同基因型數(shù)目、等位基因頻率及基因型頻率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果列于表1。經(jīng)χ2檢驗(yàn),所測的秦川牛、荷斯坦牛、晉南牛、南陽牛和延邊牛處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05),而中國西門塔爾牛的基因型頻率處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài)(P<0.05)。由表1可以看出,FHSR基因的5′端在6個(gè)品種間均表現(xiàn)出多態(tài)性,其基因頻率和基因型頻率均有較大差異。從基因型來看,AA純合子的頻率大小依次為:南陽牛(0.9268),秦川牛(0.4167),延邊牛(0.2667),晉南牛(0.2143),中國西門塔爾牛(0.1471),荷斯坦牛(0.1250);雜合子AB的頻率大小依次為:中國西門塔爾(0.7353),延邊牛(0.5333),秦川牛(0.5000),晉南牛(0.4286),荷斯坦牛(0.2813),南陽牛(0.0714);純合子BB的頻率依次為:荷斯坦奶牛(0.5938),晉南牛(0.3571),延邊牛(0.2000),中國西門塔爾牛(0.1176),秦川牛(0.0833),南陽牛(0.0000);等位基因A的頻率大小依次為南陽牛(0.9643),秦川牛(0.6667),延邊牛(0.5333),中國西門塔爾牛(0.5147),晉南牛(0.4286),荷斯坦牛(0.2656),等位基因B的頻率順序與基因A相反。2.4聚合型雙胎污染的基因頻率和基因型頻率將秦川牛、荷斯坦牛以及中國西門塔爾牛有雙胎和非雙胎牛群的等位基因和基因型頻率進(jìn)行比較,結(jié)果見表2。經(jīng)χ2檢驗(yàn),秦川牛的單胎和雙胎牛群等位基因位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05);荷斯坦牛的單胎牛群也處于平衡狀態(tài)(P>0.05),但雙胎牛群的基因位點(diǎn)表現(xiàn)并不平衡(P<0.05)。對中國西門塔爾牛,按雙胎母牛、種用公牛和隨機(jī)母牛(不知道產(chǎn)過雙胎與否,隨機(jī)抽樣)分3種類群,計(jì)算基因頻率和基因型頻率并作統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)隨機(jī)樣本牛群處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05);而雙胎母牛和種用公牛處于非平衡狀態(tài)(P<0.05)。以上不平衡現(xiàn)象可能是由于對種用公?；螂p胎母牛樣本施加的選擇打破了該位點(diǎn)的平衡。秦川牛雙胎母牛的純合子基因型AA的頻率高于單胎母牛,單胎母牛AB基因型的頻率較高,二者BB基因型的頻率相同。相應(yīng)地,雙胎母牛A基因頻率高于單胎母牛。因此,就秦川牛而言,等位基因A在雙胎牛中是優(yōu)勢基因,尤其是AA純合子。而荷斯坦牛雙胎母牛的BB基因型頻率高于單胎母牛,從基因頻率看,雙胎母牛的B基因頻率均高于單胎母牛,在后代中也表現(xiàn)出相同的趨勢。另外,4個(gè)雙胎母牛后代中有3個(gè)和母親的基因型一致,為BB型。所以,在荷斯坦牛雙胎母牛的B基因?yàn)閮?yōu)勢基因,尤其是BB純合型。在中國西門塔爾牛的3個(gè)類群中,雙胎母牛和種公牛的雜合子基因型AB高于隨機(jī)母牛,雙胎母牛和種用公牛的B等位基因頻率高于A等位基因頻率。2.56邊牛和東南角牛的距離對6個(gè)牛品種間Nei氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離的計(jì)算結(jié)果列于表3。由表3可以看出,延邊牛和西門塔爾牛的距離最近(0.01034),荷斯坦牛和南陽牛的距離最遠(yuǎn)(0.98170)。根據(jù)表3畫出系統(tǒng)聚類圖(圖2),由圖2可見,西門塔爾牛和延邊牛首先聚在一起,然后晉南牛、秦川牛、荷斯坦牛、南陽牛依次加入。3fshr基因5的pcr-rflp標(biāo)記的應(yīng)用問題目前,國內(nèi)外對牛FSHR基因的多態(tài)性、牛群體遺傳關(guān)系及牛雙胎性狀的遺傳標(biāo)記研究報(bào)道很少,所以無論是試驗(yàn)設(shè)計(jì),還是試驗(yàn)方法都是一種探索,雖然取得了一定的結(jié)果,但仍有許多問題有待進(jìn)一步研究。1)對3個(gè)有單、雙胎記錄牛品種的分析發(fā)現(xiàn),雙胎性狀的優(yōu)勢基因型和等位基因在不同品種內(nèi)表現(xiàn)不一致,如秦川牛為AA和A,荷斯坦牛為BB及B,在后代中也有同樣的趨勢,中國西門塔爾牛的雙胎母牛、隨機(jī)母牛及種用公牛類群中為AB及B。鑒于以上分析結(jié)果,可以認(rèn)為FSHR基因5′端的PCR-RFLP標(biāo)記,在同一品種單胎母牛和雙胎母牛之間有相同趨勢,但不同品種的趨勢不同,因此該標(biāo)記尚不能作為雙胎標(biāo)記的必要條件。另外,該基因位點(diǎn)可能存在品種特異性,如秦川牛是我國的地方品種,而中國荷斯坦牛和中國西門塔爾牛均是引進(jìn)培育品種,這3個(gè)品種雖然都屬于黃牛,但在長期的培育和進(jìn)化過程中,其遺傳基礎(chǔ)肯定發(fā)生了分化,從而表現(xiàn)出了品種特性,如在采樣時(shí)發(fā)現(xiàn)秦川牛的母牛大多在第7~9胎時(shí)產(chǎn)雙胎,而本研究中的荷斯坦牛所產(chǎn)的雙胎均在5胎以前,以第二胎雙胎率最高。所以仍需進(jìn)一步研究FHSR基因5′端的PCR-RFLP對雙胎性狀的標(biāo)記,這對于品種內(nèi)雙胎牛的選育或許有一定價(jià)值。但不同的牛品種表現(xiàn)出不一致的現(xiàn)象,說明用一個(gè)位點(diǎn)來標(biāo)記牛的雙胎性狀值得商榷,就雙胎這個(gè)閾性狀而言,