大腸癌中h16、rb和p27基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的改變及意義

在結(jié)腸癌的發(fā)生過(guò)程中，不同程度的癌基因和（或）抑癌基因的變化可能會(huì)導(dǎo)致癌基因和癌基因的變化。研究表明,細(xì)胞周期相關(guān)基因p16、Rb和p27的失活與多種腫瘤有關(guān),它們的失活方式有缺失、突變和啟動(dòng)子區(qū)甲基化等。DNA甲基化是基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的重要方式之一,在限制或關(guān)閉基因表達(dá)中起重要作用。作者采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation-specificpolymerasechainreaction,MSP)方法檢測(cè)大腸癌組織中p16、Rb和p27基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài),并分析其甲基化狀態(tài)與蛋白產(chǎn)物的表達(dá)及大腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。1材料和方法1.1肺癌病例手術(shù)切緣所見(jiàn)收集2001年1至12月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院、新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院和新鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院手術(shù)切除的大腸癌標(biāo)本56例,腺瘤42例,同時(shí)切取大腸癌患者手術(shù)切緣正常組織,所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢驗(yàn)證實(shí)。56例大腸癌患者,男31例,女25例;年齡37～76(53.6±5.2)歲;高分化腺癌23例,中分化腺癌30例,低分化腺癌3例;浸潤(rùn)至黏膜下層24例,肌層32例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例,無(wú)33例?；颊咝g(shù)前均未接收放療或化療。1.2聚合酶和nd-pcr聚合酶亞硫酸鈉和氫醌等為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;基因組DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、dNTPs和TaqDNA聚合酶等為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品;RNA酶A、蛋白酶K和瓊脂糖等為德國(guó)Merk公司產(chǎn)品;100bpDNAMarker為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品;氫氧化鈉為國(guó)產(chǎn)分析純;PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。1.3pcr擴(kuò)增dna1.3.1基因組DNA的提取、修飾及純化組織離體后立即提取基因組DNA,按基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作并定量,然后按文獻(xiàn)方法略作修改進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾:取2μg基因組DNA,于20μL氫氧化鈉(0.5mol/L)中37℃變性15min,加入30μL氫醌(10mmol/L)和520μL亞硫酸氫鈉(3mol/L,pH5.0)并混勻,50℃修飾16h后,按說(shuō)明書(shū)純化回收修飾的基因組DNA。-20℃保存?zhèn)溆谩?.3.2MSP以經(jīng)過(guò)修飾并純化的基因組DNA為模板,采用MSP方法檢測(cè)各樣品中p16、Rb和p27基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。引物序列和產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10min;94℃變性45s,60℃(p16U)或65℃(p16M)或55℃(RbM和RbU)或66℃(p27M和p27U)退火45s,72℃延伸45s,35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5min。產(chǎn)物經(jīng)18g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察并照相。1.4常模型的檢測(cè)采用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,腺瘤與正常組織、不同臨床病理特征大腸癌組織間3種基因甲基化率的比較采用χ2檢驗(yàn),大腸癌與正常組織間3種基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率的比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn),大腸癌組織中3種基因甲基化狀態(tài)與蛋白表達(dá)的分析采用列聯(lián)系數(shù)rp評(píng)價(jià),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。2結(jié)果2.1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化合物檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。2.2表3顯示了p16、rb和p27基因啟動(dòng)子區(qū)域指甲狀化狀態(tài)以及蛋白發(fā)現(xiàn)之間的關(guān)系2.3p16和p27基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系見(jiàn)表4。3啟動(dòng)子區(qū)基因表達(dá)與正常組織的關(guān)系DNA甲基化可能通過(guò)直接和間接2種機(jī)制調(diào)控基因表達(dá),基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化可干擾一些轉(zhuǎn)錄因子與基因調(diào)控區(qū)的結(jié)合或抑制RNA聚合酶活性而直接抑制基因表達(dá);甲基化DNA與特異結(jié)合蛋白結(jié)合或甲基化改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)可間接阻礙轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合,從而抑制轉(zhuǎn)錄。近年來(lái),基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化引起的腫瘤抑制基因失表達(dá)已成為腫瘤研究的焦點(diǎn)之一。作者采用MSP方法檢測(cè)了56例大腸癌和42例大腸腺瘤組織中p16、Rb和p27基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài),并分析甲基化狀態(tài)改變與蛋白表達(dá)的關(guān)系,結(jié)果顯示:腺瘤和癌組織中p16和p27基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率均顯著增加,而Rb基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率無(wú)明顯增加,而且正常、腺瘤和癌組織中Rb基因啟動(dòng)子區(qū)均呈低水平的甲基化。p16和p27基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化影響了其蛋白表達(dá),而Rb基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與蛋白表達(dá)無(wú)關(guān)聯(lián)。提示大腸癌組織中啟動(dòng)子區(qū)高甲基化是p16和p27基因失活的主要機(jī)制,抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可能是腫瘤發(fā)生與演進(jìn)的重要事件。但是,該研究結(jié)果還提示大腸癌組織中Rb基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能在Rb的失活中不起主要作用,深入的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。分化程度、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等是評(píng)價(jià)腫瘤特別是惡性腫瘤惡性生物學(xué)行為的重要指標(biāo)。該研究結(jié)果顯示:p16基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化與大腸癌的分化程度、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切;p27高甲基化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Arnold等以具有