姜黃素對葡萄糖氧化酶氧化應(yīng)激及胰島素抵抗的影響

氧氣化合物應(yīng)激活肝細(xì)胞疾病的發(fā)生和發(fā)展。促進(jìn)氧化物的主要來源是由氧氣產(chǎn)生的反應(yīng)性氧原（ros），這對肝細(xì)胞疾病的發(fā)生起著重要作用。胰島素抵抗(IR)是指正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài),氧化應(yīng)激狀態(tài)下胰島素抵抗水平增加。姜黃素可以通過激活NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)核轉(zhuǎn)位,增加具有抗氧化功能的Ⅱ相代謝酶的合成,減低細(xì)胞ROS水平。在諸如抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、抗炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮廣泛的細(xì)胞保護(hù)功能。能否通過姜黃素干預(yù)減輕ROS引起的IR,目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)用姜黃素干預(yù)人肝細(xì)胞系LO2,觀察Nrf2核轉(zhuǎn)位對細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷引起的肝細(xì)胞胰島素抵抗的保護(hù)作用。1材料和方法1.1探針和檢測試劑人肝細(xì)胞系LO2購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢);超氧化物陰離子熒光探針購自江蘇碧云天公司;丙二醛、ALT、AST和GSH檢測試劑盒購自南京建成公司;姜黃素、葡萄糖氧化酶、胰島素均購自美國Sigma公司。1.2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型制備將細(xì)胞加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)48h,細(xì)胞分為對照組,模型組和干預(yù)組,每組細(xì)胞數(shù)約為5×106個。對照組正常培養(yǎng),未給予葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase,GO)和姜黃素干預(yù);模型組先加入不含姜黃素的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)12h,然后加入100mU/mlGO干預(yù)2h,制備細(xì)胞氧化應(yīng)激模型,干預(yù)組加入含30μmol/L姜黃素的培養(yǎng)液干預(yù)12h,然后給予100mU/mlGO干預(yù)2h。取細(xì)胞上清液進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。各組細(xì)胞用預(yù)熱的PBS沖洗2遍,用含100nmol/L胰島素的RPMI1640培養(yǎng)30min,取上清液檢測培養(yǎng)液中殘存的葡萄糖含量。1.3觀察指標(biāo)的方法1.3.1干預(yù)不同培養(yǎng)液對姜黃素的活性LO2細(xì)胞貼壁生長在蓋玻片上,干預(yù)組用30μmol/L姜黃素的培養(yǎng)液分別干預(yù)6h和12h,對照組不做特殊處理。4%多聚甲醛固定,用FITC標(biāo)記的二抗進(jìn)行熒光染色,免疫熒光法觀察LO2細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位情況。1.3.2mda檢測方法將各組細(xì)胞的培養(yǎng)液收集,用硫代巴比妥酸(TBA)法進(jìn)行MDA檢測。將各組細(xì)胞的培養(yǎng)液倒掉后,將細(xì)胞裂解后按說明書測定GSH水平,在340nm讀取吸光度值。1.3.3檢測ast和ast收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液,用貝克曼CX-9全自動生化分析儀速率法檢測。1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞用4μmol/L的超氧化物陰離子熒光探針標(biāo)記30min后,加入4%多聚甲醛固定30min,用流式細(xì)胞儀檢測。最大激發(fā)波長370nm,最大發(fā)射波長610nm。1.3.5葡萄糖的提取各組細(xì)胞用預(yù)熱的PBS沖洗2遍,用含100nmol/L胰島素的RPMI1640培養(yǎng)30min,取上清液用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法(GOD-POD)法檢測培養(yǎng)液中殘存的葡萄糖含量。1.4pss14.0數(shù)據(jù)處理各組所得計量數(shù)據(jù)采用ˉx±s表示,用SPSS14.0軟件處理數(shù)據(jù),用完全隨機(jī)設(shè)計資料的方差分析,組間均數(shù)比較用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1熒光抗體結(jié)合nrf2的作用姜黃素能夠誘導(dǎo)Nrf2的核轉(zhuǎn)位,可見胞核中FITC標(biāo)記的熒光抗體結(jié)合Nrf2,30μmol/L濃度時12h作用優(yōu)于6h,見圖1(見第382頁)。2.2干預(yù)前后alt、ast比較模型組ALT、AST較對照組顯著升高(P<0.01),干預(yù)組ALT、AST較模型組顯著降低(P<0.01),但干預(yù)組ALT、AST仍顯著高于對照組(P<0.01)(見表1)。2.3干預(yù)組與對照組mda的比較模型組MDA較對照組顯著升高(P<0.01),干預(yù)組MDA較模型組顯著降低(P<0.01),但干預(yù)組MDA仍顯著高于對照組(P<0.01);模型組GSH較對照組顯著減低(P<0.01),干預(yù)組GSH較模型組顯著升高(P<0.01),但干預(yù)組GSH仍顯著低于對照組(P<0.01),見表2。2.4ros陽性細(xì)胞熒光強(qiáng)度比較模型組ROS陽性細(xì)胞熒光強(qiáng)度較對照組顯著升高(280.29±7.86vs107.44±5.37,P<0.01),干預(yù)組ROS陽性細(xì)胞熒光強(qiáng)度(184.65±6.51)較模型組顯著降低(P<0.01),仍顯著高于對照組(P<0.01)。2.5上清液殘余葡萄糖濃度模型組上清液殘余葡萄糖濃度為(17.56±0.38)mmol/L,較對照組(10.75±0.13)mmol/L顯著升高(P<0.01),干預(yù)組上清液殘余葡萄糖濃度(14.09±0.17)mmol/L較模型組顯著降低(P<0.01),但干預(yù)組上清液殘余葡萄糖濃度仍顯著高于對照組(P<0.01)。3氧化應(yīng)激作用本研究表明GO預(yù)處理肝細(xì)胞LO2可以引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平增高,導(dǎo)致肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,姜黃素可以通過促進(jìn)LO2細(xì)胞的Nrf2核轉(zhuǎn)位,同時可以降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平,也可以減輕肝細(xì)胞損傷和胰島素抵抗。推測姜黃素通過促Nrf2核轉(zhuǎn)位引起Ⅱ相酶的合成,降低細(xì)胞內(nèi)活性氧,進(jìn)而改善胰島素抵抗。姜黃素是一種天然的抗氧化物質(zhì),屬于多酚類化合物,幾乎無毒,在生物體內(nèi)顯出較強(qiáng)的抗氧化性。在既往的研究中發(fā)現(xiàn),姜黃素能有效促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)位,與其相應(yīng)的順式作用元件結(jié)合,調(diào)節(jié)絕大多數(shù)抗氧化基因的表達(dá),表達(dá)具有抗氧化作用的Ⅱ相酶的合成,包括過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、血紅素氧合酶-1、谷胱甘肽過氧化物酶等。MDA作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一,可以反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,間接地反映細(xì)胞氧化損傷程度。超氧化物陰離子熒光探針(DHE)可以直接用于活細(xì)胞的標(biāo)記,其被活細(xì)胞攝入后,可以在細(xì)胞內(nèi)的超氧化物陰離子作用下脫氫,產(chǎn)生溴化乙錠,溴化乙錠可以和RNA或DNA結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的超氧化物陰離子水平較高時,產(chǎn)生的溴化乙錠較多,紅色熒光就較強(qiáng),這樣就可以用DHE進(jìn)行超氧化物的檢測。ALT、AST能敏感提示肝細(xì)胞損傷及其損傷程度;GSH的活性成分為還原型谷胱甘肽,參與體內(nèi)氧化還原過程,保護(hù)細(xì)胞膜中含巰基的蛋白質(zhì)和含巰基酶不被破壞,同時還可對抗自由基對重要臟器的損害。本實(shí)驗(yàn)通過GO與培養(yǎng)基中的葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)生H2O2對細(xì)胞造成氧化應(yīng)激,發(fā)現(xiàn)模型組MDA、ALT、AST和細(xì)胞內(nèi)ROS水平均高于對照組,而姜黃素干預(yù)組上述指標(biāo)較模型組降低。模型組GSH較對照組減低,姜黃素干預(yù)組則較模型組升高。提示姜黃素能有效減低氧化應(yīng)激損傷,發(fā)揮對肝細(xì)胞的保護(hù)作用。氧化應(yīng)激能夠激活絲氨酸激酶的級聯(lián)反應(yīng)。這些激酶是胰島素信號通路的潛在靶點(diǎn),包括胰島素受體(insulinreceptor,IR)和胰島素受體底物(insulinreceptorsubstrate,IRS)家族。IR和IRS中絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)磷酸化水平升高會降低其酪氨酸的磷酸化水平,從而削弱胰島素的作用。絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)的磷酸化抑制IRS、IR及下游分子結(jié)合,尤其是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K),導(dǎo)致胰島素的作用包括胰島素活化蛋白激酶B的激活和葡萄糖運(yùn)輸減弱。另外,氧化應(yīng)激可使酪氨酸磷酸酶類(PTPases,具有磷酸化和去磷酸化雙重作用)失活。這些酶在調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)包括應(yīng)激活化信號通路中具有