正常尿液中蛋白質(zhì)的電泳圖譜初步建立

腎衰竭是血液通過腎衰竭、腎衰竭和分泌產(chǎn)生的最終代謝產(chǎn)物。它具有多種信息，包括身體疾病的發(fā)生、發(fā)展和預后，以及身體的整體新陳代謝狀態(tài)。與血清等其他體液樣品相比，它具有無創(chuàng)傷性和收集性，蛋白質(zhì)的組成相對簡單且易于分析。蛋白質(zhì)組學則是詮釋蛋白所攜帶信息的最有效方法,為建立適合常規(guī)檢驗人群尿樣處理的尿液蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜,選擇重復性好、獨立清晰的蛋白質(zhì)位點進行質(zhì)譜鑒定,多點全方位同時分析正常尿蛋白基本組成,為疾病的比較做正常參照體系,我們挑選了一定蛋白含量、一定清晰度、適合目前檢驗方法最小檢測限之上的30個點進行分析,為分析泌尿系統(tǒng)疾病的尿液差異性改變提供對比資料。1材料和方法1.1材料表面1.1.1來自本地格式的資源收集我院2009年3月體檢中心4例正常人的清潔中段尿,男女各2例,平均年齡為35.5歲,均為體檢健康的志愿者。1.1.2試劑和儀器二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)和考馬斯亮藍購自于美國Sigma公司;固相PH梯度干膠條(IPG,Strip3-10,17cm)、兩性電解質(zhì)(Pharmalyte,PH3-10)、覆蓋液、低分子量標準蛋白質(zhì)、尿素、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、SDS、Tris-HCL和CHAPS購自于美國BIO-RAD公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。日立70802ISE生化分析儀購自日本;PROTEANIEFCell等電聚焦儀購自于BIORAD公司;PROTEANⅡxi2-DCell垂直電泳槽,GS-800CalibratedDensitometer凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像,用PDQuest2D分析軟件對圖像進行凝膠圖像分析。1.2方法1.2.1總蛋白濃度檢測收集晨起清潔中段尿100mL,2h內(nèi)4℃1500r/min離心15min,收集上清液,棄去細胞碎片和核,上清液在血細胞計數(shù)板觀察無細胞或顆粒,取上清液與-20℃預冷純丙酮1∶1混勻,4℃靜置15min,12000r/min離心5min,棄上清,將沉淀溶于樣品裂解液(9mol/LUrea、4%CHAPS、65mmol/LDTT、0.5%兩性電解質(zhì))中,超聲10Hz、10s冷卻50s重復6次,4℃12000r/min離心10min,取上清,過除鹽柱除鹽,蛋白質(zhì)干粉溶于裂解液中,日立7080-ISE生化分析儀檢測總蛋白濃度。分裝,-80℃凍存?zhèn)溆谩?.2.2ipg膠凝劑的制備(1)固相等電聚焦:參照BIO-RAD公司操作指南進行,電泳上樣總體積約450μL(約1500μg總蛋白),一向條件為:50V低壓水化16h,然后進行等電聚焦,總電壓時間為60000Vh。(2)平衡:等電聚焦后,迅速取出IPG膠條分別于第一步和第二步平衡液中振搖15min,用濾紙條吸取多余的平衡液。(3)SDS垂直電泳:將平衡后的IPG膠條移至12%的凝膠上端,起始電壓為100V,待樣品進入SDS膠濃縮成一條線,0.5h后加大電壓到200V。直至溴酚藍到達凝膠底邊處停止電泳。1.2.3考馬斯亮藍3g50染液染色凝膠固定液(40%乙醇,10%乙酸)固定30min后,雙蒸水沖洗5min3次,考馬斯亮藍G250染液(0.12%考馬斯亮藍G250,10%硫酸銨,10%磷酸,20%甲醇)染色過夜,脫色液(40%甲醇,10%乙酸,雙蒸水至100%)進行褪色直至背景清晰。1.2.4凝膠成像和蛋白分析利用GS-800CalibratedDensitometer凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像,PDQuest2D分析軟件對圖像進行背景消減、斑點檢測、匹配以及斑點位置重復性的系統(tǒng)分析,尋找其固定表達蛋白。1.2.5指紋圖譜的鑒定篩選出正常尿液蛋白圖譜上蛋白重復性好、表達清晰、界限較明顯的蛋白斑點,送中國科學院生物物理研究所基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)進行肽指紋圖譜鑒定。1.2.6蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫的搜索2結(jié)果2.1垂直電泳檢測采用固相化pH梯度等電聚焦為第一向和SDS均一膠(T=12%)的垂直電泳為第二向,按照上述各實驗步驟,提取正常人尿蛋白,尿蛋白用17cm,pH3~10的IPG膠條進行二維電泳,獲得了清晰度高、重復性良好的考染雙向凝膠電泳圖。正常人的尿蛋白電泳圖譜見圖1。2.2質(zhì)譜分析條件從左到右pH值為3~10,從上到下分子量遞減。選取圖中表達點分子量約18~94kD,pH值在3~10范圍內(nèi)重復性好、染色清晰、界限明顯的30個蛋白位點進行質(zhì)譜分析,位點位置見圖2。2.3最佳匹配的確定將每個切取蛋白點做質(zhì)譜,質(zhì)譜結(jié)果進行生物信息學分析,每個點取最高分值對應的蛋白質(zhì)作為匹配結(jié)果,共有28個點獲得有效匹配,其中編號18與20的兩個點未得到有效匹配。見表1。3正常尿蛋白檢測自從提出“尿蛋白組學”(urinaryproteomics)概念以來,利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)對尿液蛋白質(zhì)進行高通量、系統(tǒng)性地分析和鑒定得到快速發(fā)展,并用于解釋生理學代謝、毒理及許多疾病的進程,尤其泌尿系統(tǒng)疾病中蛋白質(zhì)的改變可直接經(jīng)尿道分泌到尿液中,因此研究尿液中蛋白質(zhì)改變可以幫助理解疾病發(fā)病機制、尋找早期診斷的生物學標記。盡管尿液的成分非常復雜,但由于尿液易獲取無創(chuàng)傷,國內(nèi)外學者目前熱衷于對生理和疾病狀態(tài)下的尿液進行蛋白質(zhì)組學分析,獲得了正常尿液標準蛋白圖譜、并研究疾病狀態(tài)下尿蛋白的變化。本實驗室在蛋白質(zhì)組學方面有著獨特優(yōu)勢,靳勝等利用2D結(jié)合MALDI-TOF技術(shù)研究分析膀胱癌組織與正常組織之間的固定差異表達蛋白質(zhì),趙旭宏等對前列腺增生的尿液蛋白質(zhì)學進行了研究,建立了成熟而穩(wěn)定的技術(shù)平臺,在此平臺的基礎(chǔ)上本實驗選擇了正常人的尿液為研究對象,初步建立正常人尿蛋白圖譜,多點全方位同時分析正常尿蛋白基本組成,為疾病的比較做正常參照體系,利于與不同疾病狀態(tài)下的尿蛋白圖譜進行鑒定、分析。本實驗中我們對正常人尿液中的蛋白質(zhì)進行分離、提純,通過雙向凝膠電泳技術(shù)獲得重復性好的正常尿蛋白電泳圖譜,利用肽指紋圖譜對染色明顯且獨立的30個蛋白斑點進行鑒定,并對結(jié)果進行數(shù)據(jù)庫檢索,每個點取最高分值對應的蛋白質(zhì)作為匹配結(jié)果,共有28個點獲得有效匹配。對其進一步進行生物信息學分析,獲取的蛋白質(zhì)包括:各種血清白蛋白(AMBP蛋白;白蛋白23kDa片段;血清白蛋白亞型1;白蛋白;假定白蛋白;未命名白蛋白);免疫分子以及補體系統(tǒng)(IGKC蛋白;人補體片段4b);各種載脂與轉(zhuǎn)運蛋白(甲狀腺素結(jié)合蛋白;載脂蛋白A1;血清轉(zhuǎn)鐵蛋白);肽酶S1家族(甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2亞型);細胞結(jié)構(gòu)蛋白(肌動蛋白A2);蛋白酶抑制因子(SERPINA1PRO2275;ITIH4);兩種未知蛋白(cDNAFLJ51445,cDNAFLJ50830,均為高度類似AMBP蛋白)等。與THONGBOONKERD等分離鑒定出的47種蛋白中包括膜蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白、受體、黏附分子、信號轉(zhuǎn)導蛋白、酶及細胞骨架蛋白等基本相符。進一步分析各蛋白的功能,例如:AMBP蛋白前體是存在于血清中的一種復合糖蛋白,降解為兩種不同功能的蛋白質(zhì)包括α1微球蛋白和bikunin。α1微球蛋白屬于載脂轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員,在炎癥過程中起調(diào)節(jié)作用。Bikunin是一種尿胰蛋白酶抑制劑,是Kunitz-type蛋白酶抑制因子超家族的一員,在許多病理生理過程中起著重要作用。ITIH4屬于ITIH家族,由1個輕鏈和5個同源重鏈組成,通過與透明質(zhì)烷共價作用使細胞外基質(zhì)處于穩(wěn)態(tài),HAMM等研究表明ITIH家族基因在乳腺癌、結(jié)腸癌以及肺癌中明顯下調(diào),推測可能為抑癌基因家族,其中ITIH4基因在結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、腎癌以及前列腺癌等實體腫瘤中下調(diào)明顯等。通過我們所獲得的正常尿液標準蛋白圖譜為參考,尋找不同疾病尿蛋白圖譜中的差異蛋白,有希望獲得新的標記物。整體分析我們所獲得的蛋白,發(fā)現(xiàn)血清白蛋白仍占主導,因為尿液是一個高度復雜的蛋白質(zhì)混合物,這些蛋白質(zhì)來自血液在腎小球中的過濾產(chǎn)物、腎的分泌物及泌尿生殖器管道的分泌物,作為一種特殊的血液過濾物,尿液中的蛋白質(zhì)組成類似于血液,在血清中占據(jù)主導地位的蛋白質(zhì)-白蛋白也成了尿液蛋白質(zhì)中最主要的成分,因此,要獲得更多有意義的尿液蛋白就要有效的去除高峰度蛋白,以獲取低峰度、含量少的蛋白質(zhì),關(guān)于這一點我們的實