?；撬嵛桂B(yǎng)對(duì)單眼剝奪大鼠視覺(jué)中樞神經(jīng)型一氧化氮合酶陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)的影響

虛弱是視覺(jué)發(fā)育敏感期的一種不可避免的障礙。目前臨床多采用心理物理方法治療弱視,輔助藥物治療少且效果不確定,深入開(kāi)展對(duì)弱視治療藥物的研究有廣泛的臨床需求。牛磺酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最豐富的游離氨基酸之一,目前被公認(rèn)為是神經(jīng)介質(zhì)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)保護(hù)性因子,已有研究顯示?；撬崾侨祟惡驮S多哺乳動(dòng)物的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),缺乏可導(dǎo)致嚴(yán)重的視功能障礙及發(fā)育異常,而補(bǔ)充牛磺酸可促進(jìn)腦發(fā)育并對(duì)多種原因引起的視覺(jué)損害起保護(hù)作用。本研究擬通過(guò)觀察?；撬釥I(yíng)養(yǎng)干預(yù)對(duì)子鼠在視覺(jué)發(fā)育關(guān)鍵期單眼剝奪后視中樞nNOS表達(dá)活性的影響,從而探討弱視的分子神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制,探討?；撬崴幬镏委熑跻暤目赡苄约捌錂C(jī)制。1材料和方法1.1河北省醫(yī)學(xué)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室新生健康雄性SD大鼠36只,體重6～8g,由河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。隨機(jī)分成3組,正常對(duì)照組(N)12只,單眼剝奪組(MD)12只,單眼剝奪牛磺酸喂養(yǎng)組(MD+Tau)12只。1.2大鼠腦層開(kāi)孔相關(guān)神經(jīng)元的檢測(cè)1.2.1單側(cè)眼瞼縫合動(dòng)物模型手術(shù)制作和飼養(yǎng):大鼠至14日齡,在乙醚吸入麻醉下行左眼眼瞼縫合術(shù),術(shù)畢放回母鼠籠,眼瞼裂開(kāi)者不納入實(shí)驗(yàn)。3組均籠養(yǎng)在同一飼養(yǎng)室的自然光線環(huán)境中,乳鼠生后22天斷奶,正常和單眼剝奪組母鼠及斷乳后子鼠用人工合成普通飼料喂養(yǎng),?；撬峤M則用?；撬犸暳衔桂B(yǎng)(在普通飼料基礎(chǔ)上加入0.6%牛磺酸)。1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)至28日齡處死并灌注固定,參照Paxion鼠腦立體定位圖譜,修取視交叉至乳頭體段腦塊,在左側(cè)大腦皮層下方及腦干下方用鋒利的剃須刀片切矢狀線做標(biāo)記,以區(qū)分左右兩側(cè)。連續(xù)冠狀冰凍切片貫穿整個(gè)視皮層V1區(qū)與外膝體,厚度40μm。切片經(jīng)0.01molPBS充分漂洗后,使用抗nNOS多克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。每個(gè)皮層標(biāo)本每隔3張切片取一張行Nissl染色。1.2.3光鏡下觀察并計(jì)算機(jī)圖像分析:參照Paxion鼠腦立體定位圖譜進(jìn)行視皮層和外膝體定位和分區(qū),各組視皮層陽(yáng)性標(biāo)本均與自身鄰近切片的Nissl染色結(jié)果對(duì)照進(jìn)行層的定位。將每組內(nèi)每只大鼠右側(cè)V1區(qū)視皮層及背外側(cè)膝狀體取在最大核團(tuán)處連續(xù)切片各5～6張,在Olympus光學(xué)顯微鏡及IPP圖像采集系統(tǒng)的10×10倍光視野下,測(cè)量nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元在右側(cè)視皮層V1區(qū)單眼反應(yīng)區(qū)各層及外側(cè)膝狀體背核的數(shù)目。數(shù)密度用免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/切片核團(tuán)面積表示。用Td2000真彩色病理、細(xì)胞圖像分析系統(tǒng),10×40倍光視野下,通過(guò)CameraLucida精確繪出每組V1區(qū)不同類型nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元200個(gè),測(cè)定其胞體截面積及樹(shù)突總長(zhǎng)度。1.3xs的表示所有數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示。應(yīng)用SPSS12.0版統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn),P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1雙極體神經(jīng)系統(tǒng)中nas的表達(dá)2.1.1在視皮質(zhì)V1區(qū),nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元散在分布于Ⅱ～Ⅵ層,以Ⅱ/Ⅲ層、Ⅴ和Ⅵ層為多,形態(tài)多樣,胞體較大,突起明顯,多數(shù)是雙極和多極非錐體神經(jīng)細(xì)胞,以成熟型為主。另外在V1區(qū)各層還有少量nNOS陽(yáng)性神經(jīng)纖維分布,纖維較細(xì)。2.1.2在外膝體,nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元集中分布于外側(cè)部,在背核呈散在分布,均為圓形或梭形的單、雙極細(xì)胞,神經(jīng)突分支很少。視皮層和外膝體陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)學(xué)均表現(xiàn)為中間神經(jīng)元。2.2圖像的計(jì)算機(jī)分析2.2.1顯著性分布p,q(MD+Tau)組、N組分別與MD組比較,在Ⅱ/Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ層均有顯著性差異(P<0.05);(MD+Tau)組與N組比較,Ⅴ和Ⅵ層均有顯著性差異(P<0.05),Ⅱ/Ⅲ層和Ⅳ層無(wú)顯著性差異(P≥0.05)。見(jiàn)表1。2.2.2兩組比較(MD+Tau)組、N組分別與MD組比較,均有顯著性差異(P<0.05);(MD+Tau)組與N組比較,無(wú)顯著差異(P≥0.05)。見(jiàn)表2。2.2.3視覺(jué)皮質(zhì)中的nn陽(yáng)性元音樹(shù)突的長(zhǎng)度MD組與N組比較有顯著性差異(P<0.05);(MD+Tau)組與MD組和N組比較,均無(wú)顯著性差異(P≥0.05)。見(jiàn)表2。2.2.4外側(cè)膝狀體背核的nnos陽(yáng)性神經(jīng)密度N、MD及(MD+Tau)3組兩兩比較,均具有顯著性差異(P<0.05)。見(jiàn)表3。3討論3.1單眼剝奪大鼠csad生命早期視覺(jué)經(jīng)驗(yàn)對(duì)于維持視功能的神經(jīng)組織發(fā)育是至關(guān)重要的,視覺(jué)剝奪可導(dǎo)致視系統(tǒng)內(nèi)部神經(jīng)元聯(lián)結(jié)重組,使剝奪眼機(jī)能分離、生理功能喪失。本實(shí)驗(yàn)顯示在大鼠視覺(jué)發(fā)育關(guān)鍵期(生后14～45天)縫合一眼導(dǎo)致本應(yīng)由剝奪眼所優(yōu)勢(shì)支配的對(duì)側(cè)視中樞因視網(wǎng)膜-膝狀核突觸退化而發(fā)生皮層和皮層下區(qū)域中NOS活性下降、NO合成減少,出現(xiàn)明顯的弱視效應(yīng),說(shuō)明單眼剝奪大鼠是一個(gè)研究視覺(jué)發(fā)育可塑性和弱視的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制的好模型。研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物在發(fā)育的不同階段合成?；撬岬哪芰κ遣煌?CSAD(?；撬岷铣上匏倜?途徑是中樞神經(jīng)系統(tǒng)牛磺酸合成主要途徑,實(shí)驗(yàn)證明幼鼠組織中CSAD活性低于成年鼠,其腦?；撬嵩谔汉托律鷥浩谕ㄟ^(guò)胎盤和乳汁由母體獲得,后期主要來(lái)源于食物。本研究在子鼠出生后即給?；撬峤M母鼠喂養(yǎng)?；撬犸嬍?斷乳后子鼠繼續(xù)給予牛磺酸飼料喂養(yǎng),觀察出生即有?；撬峁?yīng)的大鼠其單眼剝奪效應(yīng)的不同。3.2?；撬釋?duì)視網(wǎng)膜nas活性的影響?；撬嵩趧?dòng)物大腦皮層、小腦、嗅球、視網(wǎng)膜等區(qū)域含量相當(dāng)豐富,中樞神經(jīng)系統(tǒng)以神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和突觸系統(tǒng)中?；撬嶙顬樨S富,其獨(dú)特的分布顯然與視網(wǎng)膜和腦的功能密切相關(guān),而且大腦皮層興奮型和抑制型細(xì)胞均富含牛磺酸,可能支持皮層細(xì)胞間信息交流。?；撬崾且曈X(jué)系統(tǒng)一種重要的神經(jīng)化學(xué)成分,在視網(wǎng)膜的含量及濃度較高,并隨動(dòng)物的種屬和年齡而變化;牛磺酸作為一種條件必須氨基酸,不但能影響視網(wǎng)膜視覺(jué)感受器發(fā)育,而且與視網(wǎng)膜的信息傳遞密切相關(guān)。?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)體基因突變小鼠體內(nèi)牛磺酸減少、生產(chǎn)力下降以及視力喪失,而后者是由嚴(yán)重的程序性死亡性視網(wǎng)膜退變所致。缺乏?；撬嵛桂B(yǎng)的貓和猴,出現(xiàn)視力丟失、視網(wǎng)膜電圖廣泛異常、光感受器形態(tài)學(xué)改變、并殃及腦皮質(zhì)的視覺(jué)區(qū),進(jìn)一步支持牛磺酸是哺乳動(dòng)物正常視力發(fā)育的基本因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合麋漫天等的研究顯示,?；撬釥I(yíng)養(yǎng)干預(yù)可通過(guò)顯著提高視覺(jué)中樞nNOS活性及改變眼球、外膝體游離氨基酸含量,對(duì)視覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)及視功能產(chǎn)生影響,并達(dá)到阻斷剝奪性弱視的作用。但關(guān)鍵的早期單眼剝奪可能導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和功能的嚴(yán)重?fù)p害,單一的?；撬嵫a(bǔ)充不能通過(guò)保留或恢復(fù)視中樞的正常功能構(gòu)筑完全補(bǔ)償剝奪影響。3.3nos在視網(wǎng)膜及視野組織化進(jìn)程中的作用自1988年Carthwaite首次提出NO在神經(jīng)系統(tǒng)的傳導(dǎo)作用后,其在神經(jīng)系統(tǒng)的作用越來(lái)越受到重視。NO作為一種逆行信使,有效地介導(dǎo)了細(xì)胞間的信號(hào)傳遞,介導(dǎo)神經(jīng)元的發(fā)育、軸突的生長(zhǎng),并可能對(duì)視覺(jué)傳導(dǎo)通路各區(qū)域間及區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元間的相互連接進(jìn)行修飾、精細(xì)化,最終建立正確的區(qū)域投射關(guān)系,形成正常的視覺(jué)功能。由于幼體的神經(jīng)發(fā)育機(jī)制與成體的學(xué)習(xí)記憶機(jī)制有許多相似性,NO擴(kuò)散性信使分子,通過(guò)強(qiáng)化或削弱突觸連接,成為與學(xué)習(xí)相關(guān)的突觸調(diào)節(jié)和神經(jīng)發(fā)育中突觸形成這兩個(gè)過(guò)程中的共同分子機(jī)制。我們已知道大鼠視覺(jué)系統(tǒng)突觸精細(xì)化調(diào)制發(fā)育與NOS表達(dá)時(shí)空相符,提示NOS活性與視覺(jué)發(fā)育的可塑性有關(guān)。GudeiroJ(1995)等認(rèn)為NO可能轉(zhuǎn)換并放大外膝體的視覺(jué)信號(hào),調(diào)控視皮層細(xì)胞的反應(yīng)。生后早期眼球摘除或剝奪弱視可以影響視網(wǎng)膜及視中樞NOS的發(fā)育。GuidoW等證明外膝體釋放的NO是與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和突觸可塑性有關(guān)的神經(jīng)調(diào)質(zhì),成年期NO聯(lián)合Ach釋放以順行方式影響網(wǎng)膜外膝體傳輸?shù)脑黾雍凸π?發(fā)育期的NO以逆行方式維持網(wǎng)膜外膝體活性依賴精致下的連接過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)也觀察到單眼剝奪引起子鼠剝奪對(duì)側(cè)初級(jí)視皮層單眼反應(yīng)區(qū)及外膝體背核nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元活性降低;?；撬嵛桂B(yǎng)可以通過(guò)增加NOS的表達(dá),彌補(bǔ)內(nèi)源性NO合成不足,從而減輕子鼠視覺(jué)發(fā)育關(guān)鍵期的單眼剝奪效應(yīng),反映nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元作為抑制性中間神經(jīng)元的一個(gè)分支,通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)NO影響內(nèi)在外膝體背核和視皮層單眼反應(yīng)區(qū)的運(yùn)轉(zhuǎn)及外膝體皮層交互作用。另外本實(shí)驗(yàn)顯示單眼剝奪對(duì)接受外膝體投射的視皮層Ⅳ層nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元活性無(wú)顯著影響,考慮剝奪對(duì)外膝體及視皮層NOS的影響可能是通過(guò)不同的機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。3.4no抑制nmda受體功能NO在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)信息傳遞是通過(guò)NO-GC-cGMP環(huán)路完成的,NO在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后,通過(guò)第二信使cGMP調(diào)控周圍細(xì)胞的功能,局部調(diào)節(jié)著對(duì)立的或互補(bǔ)的細(xì)胞反應(yīng)。NO亦通過(guò)此途徑影響突觸可塑性如長(zhǎng)時(shí)程突觸增強(qiáng)(LTP)、長(zhǎng)時(shí)程突觸抑制(LTD)。在興奮性突觸傳遞中,NMDA受體-NO-cGMP通路被證實(shí)普遍存在于LTP等過(guò)程,內(nèi)源性NO介導(dǎo)了NMDA引發(fā)的興奮性,成為NMDA的功能執(zhí)行者之一,該過(guò)程存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng),維持神經(jīng)元的正常興奮性,參與LTP的產(chǎn)生、維持及突觸可塑性的建立。然而在生理?xiàng)l件下有活性的一系列有效地抑制同時(shí)限制這種串聯(lián),包括NO抑制NMDA受體功能,NO通過(guò)其活性依賴突觸可塑性形式實(shí)現(xiàn)對(duì)突觸功能的正負(fù)調(diào)節(jié)作用,動(dòng)態(tài)改變皮層網(wǎng)絡(luò)的有效強(qiáng)度,在大腦皮層信息處理中起重要作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NOS神經(jīng)元是GABA能神經(jīng)元的組成部分,NO和GABA的釋放是相互抑制的,且大鼠胚胎期及斷乳前腦組織較高濃