體細(xì)胞核移植重編程王心、技術(shù)簡介 技術(shù)名稱：體細(xì)胞核移植重編程 名詞解釋：誘導(dǎo)已分化體細(xì)胞發(fā)生去分化，使之成為一種具有胚胎干細(xì)胞特征的多能狀態(tài)的過程。[1]不改變基因序列的情況下，通過表觀遺傳修飾如DNA甲基化來改變細(xì)胞命運(yùn)。 技術(shù)特點(diǎn)：避免異體移植產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)。 相關(guān)技術(shù)：體細(xì)胞核移植、細(xì)胞融合等。 分類：目前重編程主要指兩個(gè)過程：分化的細(xì)胞逆轉(zhuǎn)恢復(fù)到全能性狀態(tài)的過程；從一種分化細(xì)胞轉(zhuǎn)化為另一種分化細(xì)胞的過程。二、引入2017年末，克隆猴“中中”和“華華”的誕生意味著與人類最相近的靈長類動(dòng)物的體細(xì)胞克隆成為了可能。此前，靈長類動(dòng)物的克隆一直是技術(shù)難題之一。 回顧克隆技術(shù)發(fā)展史，克隆羊“多利”的降生，證明了哺乳動(dòng)物可以被克隆，此后，小鼠，豬，牛，馬……多種動(dòng)物都被成功克隆，然而克隆猴卻遇到瓶頸。二、背景 1962年，英國科學(xué)家約翰·戈登通過克隆青蛙實(shí)驗(yàn)證實(shí)：細(xì)胞核具備發(fā)育個(gè)體所需的遺傳信息，他用成熟腸細(xì)胞的細(xì)胞核替換了青蛙卵細(xì)胞的細(xì)胞核，發(fā)育為性成熟的成體青蛙。[2]由此，我們得知卵細(xì)胞質(zhì)能重編程體細(xì)胞核，即分化細(xì)胞的細(xì)胞核在移植進(jìn)入卵母細(xì)胞質(zhì)中后，能夠指導(dǎo)卵細(xì)胞發(fā)育。[3]1998年，Wilmut等在哺乳動(dòng)物中完成體細(xì)胞核移植，獲得克隆羊“多利”，證實(shí)哺乳動(dòng)物的卵細(xì)胞中具備將體細(xì)胞核重編程的條件。2001年，Tada的實(shí)驗(yàn)表明：除卻卵細(xì)胞質(zhì)，胚胎干細(xì)胞質(zhì)在核移植細(xì)胞融合后也能重編程體細(xì)胞核。2006年，日本科學(xué)家山中伸彌用Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc(OSKM)4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子就可以把小鼠胚胎成纖維細(xì)胞重編程到多能性狀態(tài)。[2]三、技術(shù)原理卵細(xì)胞的重編程機(jī)制[4]：卵子有重編程已經(jīng)定向分化了的精子細(xì)胞核的能力，相關(guān)研究利用卵母細(xì)胞探索卵細(xì)胞的重編程機(jī)制：許多移植進(jìn)卵母細(xì)胞生殖泡的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核被直接重編程而表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志基因，包括Oct4,Nanog和Sox2。在卵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的細(xì)胞核重編程不會(huì)產(chǎn)生新的細(xì)胞與這個(gè)重編程伴隨而生的機(jī)制包括：異染色體的開放；分化標(biāo)記，如DNA甲基化的去除；組蛋白修飾以及組蛋白交換……。（機(jī)制發(fā)生的基礎(chǔ)是，受精卵擁有能引起上述效應(yīng)的高濃度特定蛋白。）如果卵子的蛋白能夠在幾秒或幾分鐘的時(shí)間內(nèi)被交換到移植進(jìn)來的體細(xì)胞核的話，那么完全重編程就應(yīng)該總會(huì)發(fā)生。但實(shí)際并非如此，可能的原因是移植進(jìn)來的細(xì)胞核攜帶了供體細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)記憶。其中組蛋白H3.3的表達(dá)被認(rèn)為能阻礙重編程的發(fā)生，并且會(huì)保留以前基因表達(dá)的記憶。表觀遺傳修飾的重編程過程： 解釋：供體細(xì)胞核移入去核的卵母細(xì)胞后,供體核停止本身的基因表達(dá)程序,恢復(fù)為胚胎發(fā)育所必需的全能性狀態(tài)。 體細(xì)胞核移植在重編程過程中最重要的是DNA甲基化和組蛋白乙?；?它們屬于染色體的改變,是可遺傳的非基因序列發(fā)生變化,即表觀遺傳學(xué)改變。大部分分化細(xì)胞中的基因表達(dá)調(diào)控就是通過這些基因修飾來進(jìn)行的。 在此，先就DNA甲基化和組蛋白乙酰化的相關(guān)原理作出簡要闡釋：DNA甲基化[1] 作用：甲基化為蛋白質(zhì)和核酸的一種重要修飾方式。 可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和關(guān)閉。 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶能將S一腺苷甲硫氨酸提供的甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到CpGs的胞嘧啶殘基上,使CpG島二核苷酸的胞嘧啶變?yōu)?一甲基胞嘧啶,這種化學(xué)反應(yīng)稱為DNA甲基化。 自然狀態(tài)下,哺乳動(dòng)物成熟的生殖細(xì)胞基因組處于高度甲基化狀態(tài)。受精后數(shù)小時(shí)內(nèi),精子基因組發(fā)生快速、主動(dòng)去甲基化,卵母細(xì)胞因在卵裂過程中依賴于DNA的復(fù)制,其基因組發(fā)生被動(dòng)地、滯后地去甲基化。到達(dá)囊胚階段時(shí),胚胎基因組甲基化水平降到最低。之后在從頭甲基化酶的作用下,附植前后的胚胎重新開始新的甲基化過程。 相關(guān)研究表明，體細(xì)胞克隆胚胎出現(xiàn)體外受精胚胎類似的去甲基化趨勢，但同時(shí)期的甲基化水平較高。在體細(xì)胞核移植過程中,供體細(xì)胞在移入去核的卵母細(xì)胞后,需要在很短的時(shí)間內(nèi)完成重編程過程。但作為供體細(xì)胞的體細(xì)胞通常具有較高的甲基化水平,因此常發(fā)生不完全重編程過程。重構(gòu)胚無法辨別供體細(xì)胞去甲基化效率低下的甲基化模式,使得重構(gòu)胚基因組很多位點(diǎn)出現(xiàn)異?；?。 解決途徑：在DNA復(fù)制過程中,人為加入的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶形成共價(jià)化合物,抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性,降低基因組甲基化水平。組蛋白乙?；?組蛋白乙酰化與轉(zhuǎn)錄活化有關(guān)。 細(xì)胞的乙?；腿ヒ阴；^程由組蛋白去乙?；?HDAC)和組蛋白乙酰化酶(HAT)調(diào)控。 HDACs能夠使組蛋白去乙?；?之后帶正電的組蛋白部分與帶負(fù)電的DNA緊密結(jié)合,致使染色質(zhì)發(fā)生致密卷曲成為阻抑結(jié)構(gòu),最終抑制基因轉(zhuǎn)錄。 相反,HATs通過在組蛋白N端賴氨酸殘基上引入疏水的乙?；菇M蛋白乙?；?增大DNA與組蛋白間的靜電引力和空間位阻,導(dǎo)致二者間的相互作用減弱,DNA易于解聚,染色質(zhì)呈轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)狀態(tài),利于轉(zhuǎn)錄因子與DNA模板相結(jié)合,最終激活基因轉(zhuǎn)錄。 體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚不能像體外受精胚胎那樣使染色質(zhì)解聚,這就使組蛋白易發(fā)生異常的乙?；Ｔ谥鼐幊踢^程中,通過抑制卵胞質(zhì)中特定的HDAC或者重編程過程中的一個(gè)因素,供體細(xì)胞核就有可能重編程的更正確。四、克隆實(shí)例克隆猴： 問題： 靈長類的克隆之所以艱難，很大程度取決于靈長類動(dòng)物的卵極為敏感(簡單的擠壓也會(huì)導(dǎo)致其異常分裂)且靈長類的細(xì)胞核非?！皯倥f”(重編程不徹底，無法指揮胚胎發(fā)育)。 解決途徑： 華裔科學(xué)家張毅博士發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核“戀舊”的本質(zhì)在于其表觀遺傳學(xué)修飾——細(xì)胞DNA上一些特殊的化學(xué)標(biāo)記。如果在克隆的過程中加入一種叫做Kdm4d的酶，就可以“擦掉”體細(xì)胞核基因的一些關(guān)鍵的表觀遺傳修飾。五、技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)：利：1).就“克隆猴”一例：基因編輯非人靈長類成為可能。猴子與人類親緣關(guān)系很近，猴子也會(huì)出現(xiàn)類似于人類的疾病，可以利用基因編輯與克隆技術(shù)迅速制作出相關(guān)的猴模型。借助這樣的動(dòng)物模型科學(xué)家可以在與人類更加相似的平臺上研究疾病的發(fā)病機(jī)制，試驗(yàn)新的治療方法。2).體細(xì)胞重編程技術(shù)的建立為臨床治療某些特殊疾病提供了很好的技術(shù)突破。如需求量大的器官移植，可以借助體細(xì)胞重編程來獲得患者自身遺傳背景來源的干細(xì)胞，再通過合適方法誘導(dǎo)分化成特殊細(xì)胞類型或器官，以達(dá)到治療的目的。[2]弊：1).就ips細(xì)胞一例：iPS細(xì)胞中存在的病毒插入基因具有致癌性。對于這個(gè)過程我們?nèi)匀恢跎?，選取的病毒載體的情況我們?nèi)詿o法確切界定。因此，在消除這些不確定因素的路上，我們還需要繼續(xù)努力，才能放心應(yīng)用。2).克隆技術(shù)帶來的倫理問題。3).通過克隆產(chǎn)生的個(gè)體具有完全相同的遺傳基因，變異減少，對疾病的敏感性相同，一種疾病的到來可能毀滅的是整個(gè)群體。參考文獻(xiàn)：[1]曹慧，蘇文龍等,哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植重編程研究進(jìn)展因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2016,35(1):100—106[2]李東偉,陳捷凱,裴端卿,誘導(dǎo)重編程的表觀遺傳調(diào)控研究進(jìn)展,

生命科學(xué),2017,29(10):1000-1006[3]細(xì)胞核重編程：從克