可吸收醫(yī)療器械植入后組織病理學(xué)樣本制備與評(píng)價(jià)方法1范圍本文件規(guī)定了可吸收醫(yī)療器械植入后局部組織病理學(xué)樣本的制備、組織反應(yīng)及降解情況的評(píng)價(jià)方法。本文件適用于可吸收醫(yī)療器械。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T16886.6醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第6部分：植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)3術(shù)語和定義GB/T16886.6界定的術(shù)語和定義適用于本文件。4概述本方法系將可吸收醫(yī)療器械植入動(dòng)物體內(nèi)一定時(shí)間后，對制備植入物周圍組織的組織病理學(xué)樣本方法進(jìn)行規(guī)范，并對可吸收醫(yī)療器械的植入后局部反應(yīng)及降解情況進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法。5組織病理學(xué)樣本制備方法5.1總則對于可吸收醫(yī)療器械植入后局部反應(yīng)組織病理學(xué)樣本制備時(shí)，組織包膜在接觸固定液之前或之后可能是開放的，小心操作避免破壞植入物/組織界面，將植入物在原位與組織完整包埋在一起，記錄植入物表面和組織界面的狀況。對于不宜取出或“硬”的植入物(可吸收人工骨、可吸收金屬、可吸收聚合物等)，可采用樹脂包埋和適宜的切片或磨片技術(shù)制備組織病理學(xué)切片，無需脫鈣處理。過程中要避免使用溶解材料的溶劑（如某些可吸收凝膠類產(chǎn)品可能溶解于固定液），如果不能避免，則要采取措施標(biāo)記材料在組織中的位置。5.2植入物取出及組織樣品采集對于可吸收醫(yī)療器械植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)，在規(guī)定的時(shí)間取材時(shí)，首先應(yīng)識(shí)別植入部位標(biāo)記物（如非侵入持久性皮膚染料、非吸收性縫合線等）來確定植入位置?？晌蔗t(yī)療器械植入早期，樣品可能不降解或微量降解,中期有可能發(fā)生實(shí)質(zhì)性結(jié)構(gòu)紊亂和/或器械碎裂，取材時(shí)盡量完整。降解后期可吸收性植入物可能基本被吸收，取材部位可能不明顯，則需擴(kuò)大取出部位，可包括預(yù)期植入位置周邊2mm～5mm的正常組織，盡可能包含任何可辨認(rèn)的殘余材料，必要時(shí)取引流淋巴結(jié)。5.3固定通過固定可保持細(xì)胞、組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，使組織硬化，便于切塊。固定時(shí)，采用適宜的固定液固定組織，組織固定不宜影響后續(xù)切片和染色過程，且固定液不宜改變植入物的物理形態(tài)和體積。5.4修整組織塊根據(jù)樣品特性和植入情況，選擇適宜的切割位置、切面來修塊，以便于后期的組織學(xué)觀察。修塊前宜詳細(xì)觀察組織樣本塊的外觀，了解樣品的植入部位、植入物位置、植入量及其他相關(guān)可參考的信息。必要時(shí)可利用X光線對植入物進(jìn)行定位后，做好標(biāo)記，再行分割。修塊過程防止樣品與組織脫離。以下列舉常見可吸收醫(yī)療器械植入后組織樣本切割方式。a)圓盤狀材料（如可吸收膜等）：一般選擇在其中心點(diǎn)縱切。b)棒狀或圓柱狀材料（如可吸收骨釘?shù)龋簩τ谄は?、肌肉組織一般選擇在中部橫切；對于腦組織、骨組織帶溝槽的圓柱形植入物，一般選擇凹槽的中央位置和植入物的平坦頂端表面縱切。c)非固形試驗(yàn)樣品（包括粉劑、凝膠等）：選擇在其植入點(diǎn)位置及植入位置周邊幾個(gè)毫米區(qū)域切割。5.5脫水組織樣本經(jīng)過固定和沖洗后，組織中含有較多的水分，宜通過脫水除去組織內(nèi)的水分。若組織脫水不當(dāng)，可能會(huì)造成細(xì)胞損傷。脫水前將組織樣本流水沖洗至少1h，沖洗過程宜輕柔小心，水流宜盡可能地小，防止可吸收醫(yī)療器械與組織脫離。常見的脫水劑為醇類，也可使用丙酮等。5.6包埋與切片對于“軟”的可吸收醫(yī)療器械（如可吸收縫線、可吸收膜、止血海綿、可吸收凝膠等），在確保樣本中保留植入材料和周圍的組織的情況下可用石蠟包埋。若組織切片時(shí)，可使用不同熔點(diǎn)和硬度的多種石蠟類型滿足不同組織的要求。包埋時(shí)宜按組織樣品切面或指定切面（一般指組織塊的最大面）向下埋入熔蠟中。對于不宜取出或“硬”的植入物（如可吸收骨釘、可吸收支架等），首選將完整組織包膜與植入物一起在原位采用樹脂包埋，采用適宜的切片或磨片技術(shù)制備組織學(xué)切片。石蠟包埋組織切片的厚度一般為4μm~8μm，切片步驟宜避免產(chǎn)生影響（例如，不適當(dāng)?shù)那衅ぷ骰虻短g導(dǎo)致的組織切片的固定相關(guān)的收縮或劃痕、褶皺或撕裂）。采用樹脂包埋切片時(shí)，采用平行粘片裝置進(jìn)行粘片，硬組織切片機(jī)進(jìn)行切片，硬組織磨片機(jī)進(jìn)行磨片。根據(jù)樣本厚度，設(shè)置合適的磨片速度，其間不斷多次利用千分尺測量切片厚度，直至所需的切片厚度。5.7染色常用的組織顯色方法有蘇木素——伊紅（HE）染色法、甲苯胺藍(lán)染色法、亞甲基藍(lán)——酸性品紅染色法、Goldner三色染色法、VanGieson苦味酸——品紅染色法等。必要時(shí)可采用免疫組化染色對可吸收醫(yī)療器械植入后組織特定類型的浸潤細(xì)胞進(jìn)行染色分析。6可吸收醫(yī)療器械植入反應(yīng)與降解評(píng)價(jià)方法6.1總體要求將試驗(yàn)樣品和對照樣品的反應(yīng)進(jìn)行比較。在相對于每個(gè)植入物的等效位置進(jìn)行試驗(yàn)植入物和對照的比較，這樣可將組織與植入物之間相對運(yùn)動(dòng)造成的影響降至最低。對照樣品應(yīng)選擇已確立臨床可接受性和生物相容性的醫(yī)療器械所采用的材料，或選取商業(yè)化可購買的臨床可接受性和生物相容性特性已普遍接受的可吸收材料作為對照樣品。當(dāng)采取可吸收材料為對照樣品時(shí)，其材料類型、降解行為（尤其是降解速率）、臨床應(yīng)用的組織部位等應(yīng)盡可能與試驗(yàn)樣品類似并加以說明?？晌蔗t(yī)療器械的降解評(píng)價(jià)，部分取決于材料的降解速率。由于降解是一個(gè)連續(xù)的過程且降解過程中可能會(huì)發(fā)生降解產(chǎn)物的“爆發(fā)”性釋放，宜對植入物各時(shí)間點(diǎn)與降解過程相關(guān)的局部組織反應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括未降解或微降解時(shí)、發(fā)生降解時(shí)、達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，即組織修復(fù)或接近完全降解。6.2可吸收醫(yī)療器械植入后局部反應(yīng)評(píng)價(jià)方法6.2.1定性分析評(píng)估和記錄的生物學(xué)反應(yīng)指標(biāo)應(yīng)包括：a)纖維化/纖維囊腔的病變范圍；以微米或半定量表示層厚和炎癥；b)植入物周圍空腔的形成；c)與材料/組織界面的距離有關(guān)的炎性細(xì)胞類型、數(shù)量和分布，即嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和多核細(xì)胞；d)出現(xiàn)壞死及其范圍程度；e)其他組織改變，如血管形成、脂肪浸潤、肉芽腫形成、礦化和骨形成；f)材料參數(shù)，如破裂和/或存在碎片、材料降解殘留物的形狀和位置；g)長入組織的定性分析（包括新生組織形態(tài)等）；h)對于骨植入物，包含植入物與組織之間的界面、植入物周圍新骨生成情況（包括編織骨、板層骨、骨髓等）以及其間存在的非鈣化組織。表1給出了對可吸收醫(yī)療器械植入后的生物學(xué)反應(yīng)進(jìn)行定性分析評(píng)價(jià)的示例。表1可吸收醫(yī)療器械植入后生物學(xué)反應(yīng)定性分析評(píng)價(jià)示例指標(biāo)定性分析細(xì)胞浸潤無細(xì)胞浸潤極少量細(xì)胞浸潤植入物裂隙（伴隨或不伴隨結(jié)締組織形成）中等程度細(xì)胞浸潤植入物裂隙中和/或植入物碎片周圍形成纖維組織重度細(xì)胞浸潤和/或大部分植入物碎片周圍纖維組織形成植入物碎片周圍廣泛存在浸潤細(xì)胞和纖維組織植入物碎片完整植入物少量降解，植入物邊緣少量裂解，植入物出現(xiàn)裂隙和/或出現(xiàn)小碎片植入物中等程度降解，植入物出現(xiàn)裂隙和/或出現(xiàn)一些植入物碎片植入物顯著降解，出現(xiàn)大量植入物碎片植入物大量降解幾乎全部成為碎片吞噬作用無吞噬輕微吞噬，少量異物巨細(xì)胞中等吞噬，一些和/或成團(tuán)的異物巨細(xì)胞顯著吞噬，植入物周圍存在數(shù)團(tuán)異物巨細(xì)胞和/或異物巨細(xì)胞區(qū)域重度吞噬，所有材料均被降解為大小不等的碎片并被巨噬細(xì)胞吞噬6.2.2半定量計(jì)分適用時(shí)，對于每項(xiàng)組織學(xué)特性評(píng)價(jià)，諸如囊腔形成、炎癥、多形核白細(xì)胞、巨細(xì)胞、漿細(xì)胞的存在和/或材料的降解，評(píng)價(jià)報(bào)告中宜描述所采用的半定量記分系統(tǒng)。除了反應(yīng)成分的記分，還宜評(píng)價(jià)所有反應(yīng)的程度。宜對每種細(xì)胞類型和新生血管形成反應(yīng)進(jìn)行說明。對于試驗(yàn)和對照樣品之間存在顯著差異值的每一細(xì)胞類型，宜解釋該差異的相關(guān)性。在這個(gè)半定量記分系統(tǒng)中，炎癥細(xì)胞浸潤和壞死用表2的記分系統(tǒng)，新生血管形成、纖維化和脂肪浸潤用表3記分系統(tǒng)。表2參數(shù)權(quán)重因子為2，表3中參數(shù)權(quán)重因子1。表2和表3總值相加后分別計(jì)算試驗(yàn)組和對照組的平均記分，從試驗(yàn)組平均記分中減去對照組的平均記分。表2組織學(xué)評(píng)價(jià)系統(tǒng)——細(xì)胞類型/反應(yīng)細(xì)胞類型/反應(yīng)記分01234多形核白細(xì)胞0極少，1phf～5phfa5phf～10phf重度浸潤滿視野淋巴細(xì)胞0漿細(xì)胞0巨噬細(xì)胞0巨細(xì)胞0極少，1phf～2phf3phf～5phf重度浸潤成片分布?jí)乃?極少輕微中度重度aphf=高倍（400×）視野表3組織學(xué)評(píng)價(jià)系統(tǒng)——組織反應(yīng)反應(yīng)記分01234新血管形成0輕微毛細(xì)血管增生，局灶性，1～3個(gè)芽4～7組毛細(xì)血管增生，輔以成纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)較大范圍的毛細(xì)血管增生，輔以成纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)廣泛毛細(xì)血管增生輔以成纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)纖維化0局限性區(qū)域中度厚區(qū)域厚區(qū)域廣泛區(qū)域脂肪浸潤0極少量脂肪細(xì)胞，伴纖維化數(shù)層脂肪細(xì)胞和纖維化植入部位脂肪細(xì)胞聚集區(qū)域延伸擴(kuò)大植入物周圍完全被脂肪細(xì)胞包繞在本半定量記分系統(tǒng)下，與對照樣品相比，該試驗(yàn)樣品被認(rèn)為對組織有以下反應(yīng)：—無刺激或極輕微刺激（0.0～2.9）；—輕度刺激（3.0～8.9）；—中度刺激（9.0～15.0）；—重度刺激（≥15.1）。6.3可吸收醫(yī)療器械植入后降解和新生組織生成的評(píng)價(jià)方法6.3.1降解率選擇在包含所有植入物視野的光學(xué)顯微鏡下，運(yùn)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。測量植入物的剩余直徑/面積/數(shù)量等半定量分析植入物剩余總量，以植入初始時(shí)的直徑/面積/數(shù)量等為初始量，按式（1）計(jì)算植入物降解率（%）。式中：A——植入物降解率；B——植入物剩余量；C——植入物初始量。6.3.2新生組織生成率當(dāng)植入物的最終目的是使組織再生時(shí)，測量植入?yún)^(qū)域內(nèi)新生組織的面積，按式（2）計(jì)算新生組織生成率（%）。式中：NB——新生組織橫截面的面積占植入物橫截面總面積的百分率；S1——植入物橫截面總面積內(nèi)所形成的新生組織的總面積；S0——植入物橫截面總面積。針對骨科可吸收植入物，必要時(shí)，宜采用微型計(jì)算機(jī)斷層掃描（mirco-CT）等影像學(xué)檢查植入物的降解和新骨生成情況。根據(jù)設(shè)備情況，選擇合適的電壓、電流和曝光時(shí)間，采用相應(yīng)的軟件計(jì)算新生骨的體積。按式（3）計(jì)算分析新生骨體積占骨缺損區(qū)域的體積比例（%）。式中：△v——新生骨體積占骨缺損區(qū)域的體積比例；V1——新生骨體積；V0——骨缺損體積。對于需要經(jīng)過同位素、熒光或其他特殊方法進(jìn)行標(biāo)記來進(jìn)行可吸收植入物降解分析，可采用相應(yīng)的測試方法進(jìn)行。7結(jié)果評(píng)價(jià)可吸收醫(yī)療器械植入反應(yīng)與降解評(píng)價(jià)應(yīng)包括：a)試驗(yàn)和對照樣品的描述，如植入樣品的識(shí)別、形狀、尺寸和形態(tài)；b)所采用的固定和組織切片制備技術(shù)，記錄每只動(dòng)物每個(gè)觀察期切取出的