艾滋病檢測實驗室操作標準濟寧市疾病預(yù)防控制中心白傳記1目錄一.管理依據(jù)二.制定相應(yīng)規(guī)章制度、平安守那么、SOP三.實驗室檢測要求〔檢測樣本的管理、檢測方法、試劑、結(jié)果的判讀、報告、質(zhì)量控制2一、管理依據(jù)法規(guī)：?病原微生物實驗室生物平安管理條例??全國艾滋病檢測工作管理方法?標準：?實驗室生物平安通用要求?標準：?生物平安實驗室建筑技術(shù)標準??全國艾滋病檢測技術(shù)標準?導(dǎo)那么：?實驗室生物平安手冊?〔WHO〕?醫(yī)學(xué)實驗室生物平安要求?〔ISO15190〕3實驗室分級1、艾滋病參比實驗室2、艾滋病檢測確證實驗室〔1〕艾滋病確證中心實驗室〔2〕艾滋病確證實驗室3、艾滋病檢測篩查實驗室

〔1〕艾滋病篩查中心實驗室

〔2〕艾滋病篩查實驗室〔3〕艾滋病檢測點——見?全國艾滋病檢測工作管理方法?4艾滋病篩查實驗室職能1、開展艾滋病病毒抗體的篩查實驗，根據(jù)需要可開展其他艾滋病檢測工作。2、負責將艾滋病病毒抗體篩查呈陽性反響的樣品送當?shù)匕滩『Y查中心實驗室。3、定期匯總艾滋病檢測資料，并上報當?shù)匕滩『Y查中心實驗室。4、對自愿咨詢檢測工作提供技術(shù)支持。5艾滋病病人確實診需要三級實驗室完成因為艾滋病是一種不能徹底治愈的傳染病，它的感染常與多性伴和吸毒等行為緊密相關(guān)。感染者不僅要面對HIV感染帶來的身心痛苦，可能還要面對歧視，或是道德上的評判，對日常工作和生活造成嚴重影響。因此，對一個人做出艾滋病的診斷要十分慎重。實驗室檢測結(jié)果是做出感染HIV診斷的惟一依據(jù)，所以，艾滋病的檢測與其他大多數(shù)傳染病的檢測不同。其檢測方法和結(jié)果報告要嚴格按照國家規(guī)定的程序進行，以維護受檢者的合法權(quán)利。6目前我省實驗室數(shù)截止到2007年8月底我省共有艾滋病檢測實驗室497個〔1〕艾滋病確證中心實驗室1個〔2〕艾滋病確證實驗室2個〔3〕艾滋病篩查中心實驗室18個

〔4〕艾滋病篩查實驗室477個

7497個艾滋病檢測實驗室在各市分布8497個艾滋病檢測實驗室系統(tǒng)分布9人員、建筑、設(shè)備要求〔一〕艾滋病篩查中心實驗室及艾滋病篩查實驗室。

1、人員條件

至少由3名醫(yī)技人員組成，其中具有中級衛(wèi)生技術(shù)職稱人員至少1名。負責篩查試驗的技術(shù)人員需具有2年以上從事病毒性疾病血清學(xué)檢測工作經(jīng)驗，接受過省級以上艾滋病檢測技術(shù)培訓(xùn)，并獲得培訓(xùn)證書。

2、建筑條件

實驗室或檢測區(qū)域應(yīng)分為清潔區(qū)、半污染區(qū)和污染區(qū)，應(yīng)符合二級生物平安實驗室〔BSL-2〕要求。

3、儀器設(shè)備條件

至少包括酶標讀數(shù)儀、洗板機、普通冰箱、水浴箱〔或溫箱〕、離心機、加樣器〔儀〕、消毒與污物處理設(shè)備、實驗室恒溫設(shè)備、平安防護用品和生物平安柜。

——見?全國艾滋病檢測工作管理方法?附件10二.規(guī)章制度、平安守那么、SOP實驗室管理制度實驗室生物平安守那么標準操作程序〔SOP〕※樣品接受，登記和處理※檢測方法和步驟※儀器使用維護和校準※實驗中的質(zhì)量控制※結(jié)果解釋與報告※保密程序※檢測數(shù)據(jù)的記錄與保存※追蹤和處理※實驗室的清理和消毒※實驗室平安防護※實驗室應(yīng)急突發(fā)事故處理制度111213編寫要求

1.SOP是書面質(zhì)量體系中的一個很重要的局部。SOP是指導(dǎo)完成檢測工作的一整套書面操作指南，因而每個實驗室應(yīng)就本實驗室所有重要工作制定相應(yīng)的SOP。2.每一個檢測工程都應(yīng)該制定一份SOP，其中包含有詳細的操作程序，例如實驗室實驗條件(溫度等)、儀器的使用和維護、試劑、質(zhì)控品、校準品的使用等(設(shè)備和試劑盒說明書作為附錄)，以防止或減少因不同的操作者所引起的誤差。3.SOP由各崗位工作人員起草，實驗室負責人審定。實驗人員在操作時應(yīng)該嚴格按照SOP進行，實驗室主管人員應(yīng)該督查實驗人員執(zhí)行SOP。必要時，SOP中的內(nèi)容，如說明書或相關(guān)內(nèi)容，應(yīng)該在實驗室主管人員的領(lǐng)導(dǎo)下進行修訂.4.每年至少修訂一次。修訂后的SOP按審批程序批準后使用。14實驗室應(yīng)有的紀錄1.工作人員培訓(xùn)紀錄2.健康監(jiān)護檔案3.實驗室出入登記〔外來人員〕4.儀器使用、維護、校準紀錄5.實驗室溫度、濕度紀錄6.各種試驗的原始紀錄7.樣本接收、保存紀錄8.試劑使用紀錄9.廢棄物處理紀錄10.質(zhì)量控制紀錄15檔案管理原始記錄包括實驗原始記錄表、打印數(shù)據(jù)、膜反響條帶或其照片、檢測記錄表、標本登記記錄、標本保存記錄以及儀器設(shè)備維修和校準記錄等重要記錄都應(yīng)該妥善存檔保存15年以上。推薦同時使用計算機保存各種文件和記錄。內(nèi)含病人姓名的所有工作記錄一定要保密。參見?標準?第8頁16三、實驗室檢測要求1.檢測樣本的管理2.檢測方法3.試劑選擇和使用4.試驗結(jié)果的判定、結(jié)果報告5.質(zhì)量控制171、檢測樣本的管理制定標準操作程序〔SOP〕，并嚴格按照要求去做樣品采集、運輸和保存樣品的采集18采集病原微生物樣本應(yīng)當具備以下條件(一)具有與采集病原微生物樣本所需要的生物平安防護水平相適應(yīng)的設(shè)備；

(二)具有掌握相關(guān)專業(yè)知識和操作技能的工作人員；

(三)具有有效的防止病原微生物擴散和感染的措施；

(四)具有保證病原微生物樣本質(zhì)量的技術(shù)方法和手段。采集高致病性病原微生物樣本的工作人員在采集過程中應(yīng)當防止病原微生物擴散和感染，并對樣本的來源、采集過程和方法等作詳細記錄。?病原微生物實驗室生物平安管理條例?19采血針201.血清、血漿2.標本采集時應(yīng)盡量防止溶血、長菌3.抗凝不完全的標本因纖維蛋白元的干擾而造成假陽性4.冰箱中保存時間過長易導(dǎo)致血清IgG聚合5.防止交叉污染標本的采集和保存21針頭處理針頭收集器正確的取針頭方式22錯誤的取針頭方式23采集樣本的本卷須知保障工作人員、病人和環(huán)境的平安保證樣品的質(zhì)量〔防止溶血、及時別離血清、合理的存放〕樣本的正確標示〔編號與登記表一致〕職業(yè)暴露的預(yù)防24樣本的保存別離血清即時檢測的樣品〔1-2天內(nèi)〕，可存放于2-8℃冰箱，最長時間一周。如需長期保存，應(yīng)將別離的血清或血漿存放于-20℃冰箱內(nèi)。選擇適宜的凍存管。25樣品的運送中華人民共和國衛(wèi)生部令第45號?可感染人類的高致病性病原微生物菌〔毒〕種或樣本運輸管理規(guī)定?已于2005年11月24日經(jīng)衛(wèi)生部部務(wù)會議討論通過，現(xiàn)予以發(fā)布，自2006年2月1日起施行。部長高強二○○五年十二月二十八日26樣品包裝采用ＷＨＯ提出的三級包裝系統(tǒng)。第一層容器：裝樣品，要求防滲漏。樣品應(yīng)置于帶蓋的試管內(nèi)，試管上應(yīng)有明顯的標記，標明樣品的編號或受檢者姓名、種類和采集時間。在試管的周圍應(yīng)墊有緩沖吸水材料，以免碰碎。第二層容器：要求耐受性好、防滲漏、容納并保護第一層容器，可裝多個第一層容器。將試管裝入專用帶蓋的容器內(nèi)，容器的材料要易于消毒處理。第三層容器：放在一個運輸用外層包裝內(nèi)，應(yīng)易于消毒。外面要貼標簽〔數(shù)量，收、發(fā)件人〕。

27第一層容器第二層容器第三層容器28平安運送：無損壞，不傾倒，無泄漏。及時運送：按時送到，不失時效必要條件：保證適宜溫度，不受污染，無失誤：無地址人名不清，造成錯送或延誤。感染性樣本的運輸要求29感染性樣本的運輸要求嚴格按照?可感染人類的高致病性病原微生物菌〔毒〕種或樣本運輸管理規(guī)定?和?全國艾滋病檢測技術(shù)標準?的要求運送。陽性樣本填寫?HIV抗體復(fù)檢化驗單?，用微機打印。送檢單工程必須填寫完全、標準。除特殊需要外，一般不能用全血。30可感染人類的高致病性病原微生物菌〔毒〕種或樣本運輸包裝標識1.高致病性病原微生物危險標簽

高致病性病原微生物制冷劑：

請勿自行打開如有破損、滲漏或遺失請立即通知當?shù)匦l(wèi)生行政部門聯(lián)系人：聯(lián)系電話：2.高致病性病原微生物運輸?shù)怯洷?/p>

3.外包裝放置方向標識

312、HIV實驗室檢測方法分類一.抗體檢測(IgG,IgM,IgA…)初篩實驗ELISA(EIA)第四代膠體金/硒層析、滲濾明膠顆粒凝集凝集法確認實驗蛋白印跡(WesternBlot,WB)免疫熒光(IFA)二.抗原檢測(P24)三.核酸檢測(RNA,DNA)四.病毒別離32抗體檢測抗體檢測診斷的金標準：HIV特異性抗體檢測EIA〔高敏感性〕+WB〔高特異性〕診斷的準確率大于99%，假陽性率約為0.0006%，造成錯誤診斷的時機幾乎是0?？贵w檢測唯一的問題是窗口期可以出現(xiàn)假陰性33實驗前試劑準備1.觀察外包裝，內(nèi)主份有無漏液，注意效期等。2.仔細閱讀說明書，嚴格按照試劑說明書進行操作。3.操作前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘，保證酶等液體的初始反響溫度及活性劑的溶解。4.核對樣本編號5.檢查孵育溫度6.檢查洗板機管道的暢通及程序7.一次性手套、隔離衣、口罩等8.消毒物品9.污物桶、缸10.做好試驗原始記錄34廠家方法包被抗原CUTOFF值陽性對照陰性對照條件北京萬泰酶免未注明陰性均值NC+0.12Ⅰ，Ⅱ型各1孔≥0.83孔≤0.1北京金豪酶免gp41;gp36;ENV180.10+N(均值）2孔2孔小于0.02按0.02計算P小于0.5，N大于0.1實驗無效安圖綠科酶免未注明0.10+N(均值）2孔3孔P大于0.7，N小于0.1，P-N大于0.6實驗無效英科新創(chuàng)酶免未注明0.10+N(均值小于0.05按0.05算）2孔2孔P大于N0.6以上，N小于0.1，實驗有效珠海麗珠酶免未注明0.15+N(均值）2孔≥0.83孔≤0.12，≤0.08按0.08算陽性對照孔間差大于30%，實驗無效英科新創(chuàng)膠體金gp120;gp41;gp3630分鐘內(nèi)判定結(jié)果上?？迫A膠體金gp160;gp41;gp36無30分鐘內(nèi)判定結(jié)果美國雅培層析法未注明最少15分鐘最多60分鐘判定結(jié)果35加樣過程應(yīng)注意的問題1.血清或血漿標本別離不好即進行加樣。2.漏加樣品或加樣量缺乏。3.加液器的校正。4.手工操作中，加樣板過多造成加樣后放入孵箱前等待時間過長。

36溫育過程中出現(xiàn)的問題及解決方法1.溫箱溫育時未貼封片或加蓋，使標本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗徹底；2.溫育時間人為延長，導(dǎo)致非特異性結(jié)合，難以清洗徹底。3.溫育時溫度不符合說明書的規(guī)定范圍。1.按規(guī)定加蓋封板膜。2.按說明步驟嚴格控制溫育時間。3.嚴格控制溫育儀器〔水浴箱、孵箱、全自動酶免〕的溫度，建議在儀器內(nèi)放置測量工具〔全自動酶免除外〕。37洗板過程中易出現(xiàn)的幾點情況1.采用手工洗板,孔與孔之間液體容易交叉，切不可隨意洗板。2.采用洗板機洗板時，洗液注入孔中量缺乏，導(dǎo)致洗板不徹底，造本錢底高。3.由于血液中纖維蛋白原，造成洗板針堵塞，抽吸不完全，造成洗板不暢，導(dǎo)致洗板效果差，直接影響本底。4.反響板過多，不能保證及時洗板，造成洗板等待時間過長，影響結(jié)果。5.洗板前先將孔內(nèi)液體甩出包被板。38顯色過程中易出現(xiàn)的問題1.顯色劑配制后放置時間過長或使用已經(jīng)變色失效的顯色劑；2.用排槍加A、B混合液時，加樣槽不夠干凈，造成花板。3.不同廠家試劑的顯色液混用。39終止和讀數(shù)時的本卷須知1．加完終止后30分鐘內(nèi)讀取數(shù)據(jù)。2．讀板時板底如果不清潔，就會導(dǎo)致所讀的數(shù)據(jù)不準確，所以在讀數(shù)前盡量保證酶標板的底部是清潔的。40初篩試劑的選擇1、初篩檢測的宗旨是防止漏檢。2、篩查試劑必須是經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準、批批檢合格、臨床評估質(zhì)量優(yōu)良、在有效期內(nèi)的試劑。目前常用的篩查試劑有酶聯(lián)免疫、顆粒凝集和其它快速診斷試劑。采供血機構(gòu)進行血液篩查應(yīng)采用HIV-1/2混合型酶聯(lián)免疫試劑。自采自供血的單位必須進行HIV抗體檢測，在尚未建立艾滋病篩查實驗室的偏遠地區(qū)可由經(jīng)過培訓(xùn)的技術(shù)人員在規(guī)定的場所用快速試劑進行血液篩查。412007年山東HIV抗體診斷試劑臨床質(zhì)量評估〔ELISA〕結(jié)果試劑真陰性真陽性假陰性假陽性敏感性%特異性%功效率%麗珠66310310095.6597.00BioMerieuxAg+Ab66310310095.6597.00萬泰66310310095.6597.00新創(chuàng)66310310095.6597.00金豪65310410094.2096.00綠科65310410094.2096.00高達65310410094.2096.00422007年山東HIV抗體診斷試劑臨床質(zhì)量評估

〔快速〕結(jié)果試劑真陰性真陽性假陰性假陽性敏感性%特異性%功效率%Determine68310110098.5599.00中新科炬68310110098.5599.00中山生物68310110098.5599.00科華68310110098.5599.00Bioline68310110098.5599.00新創(chuàng)67310210097.1098.00PA65310410094.2096.0043ELISA和PA對強陽性樣品的滴度測定稀釋度252627282929210211212ELISA(O.D.)OverOverOverOver2.8962.5612.4972.3852.372PA+++++++++稀釋度213214215216217218219220221ELISA(O.D.)1.9941.5481.2781.1650.9320.9430.7900.6880.474PA+++++++++稀釋度222223224225226227228229230ELISA(O.D.)0.3680.3450.2680.2420.2470.2350.1520.1170.105PA+±±±－－－－－所用ELISA試劑為生物梅里埃HIV?試劑盒,其Cutoff值為0.15044ELISA和雅培測定比照編號12345678910靶值3.002.932.672.351.320.720.510.050.040.02ELISA結(jié)果+++++++---雅培結(jié)果+++---+---雅培結(jié)果+++---+---雅培結(jié)果++++------雅培結(jié)果+++---±---雅培結(jié)果+++-------雅培結(jié)果++++-++---雅培結(jié)果+++--+----雅培結(jié)果++++------雅培結(jié)果+++-+-----9個實驗室結(jié)果均為+++-------所用ELISA試劑為麗珠HIV?試劑盒,其Cutoff值為0.23045結(jié)果判定?藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理標準?〔GMP〕?新生物制品審批方法?于1999年3月26日經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局局務(wù)會審議通過，現(xiàn)予發(fā)布。本規(guī)定自1999年5月1日起施行。CUTOFF值確實定：正常人標本測定人數(shù)應(yīng)在400人份以上，所得數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理。通常是陰性對照均值+常數(shù)嚴格按照說明書要求判定結(jié)果46報告1.對HIV抗體篩查試驗，呈陰性反響者可出具“HIV抗體陰性〞報告。2.對初篩試驗呈陽性反響者不能出陽性報告，可出具“HIV抗體待復(fù)查〞報告。見?全國艾滋病檢測技術(shù)標準?附表147臨床由于HIV檢測導(dǎo)致的醫(yī)療糾紛

1，陽性結(jié)果未確認就報告給被檢驗者。但確認為陰性。2，使用不標準試劑的檢測結(jié)果被告知。3，使用低質(zhì)量試劑，造成陽性漏檢，但病人手術(shù)輸血后發(fā)現(xiàn)HIV。4，檢測HIV的記錄未有詳細標準記錄。在“舉證倒置〞中陷于不利地位。48例如149例如2:王××女21歲504、質(zhì)量控制實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制 ——樣品接收-處理-檢測-報告樣品保存實驗外對照質(zhì)控品的應(yīng)用質(zhì)控圖標準操作程序設(shè)備/環(huán)境質(zhì)控數(shù)據(jù)質(zhì)控……51內(nèi)、外部對照質(zhì)控血清1、內(nèi)部對照質(zhì)控血清是指每個試劑盒內(nèi)廠方提供的一套陰性和陽性對照〔弱陽性對照〕2、是為了監(jiān)控實驗的重復(fù)性和試劑盒的穩(wěn)定性而由實驗室自己制備的對照。3、理想的外部對照應(yīng)該包括陽性對照、弱陽性對照、臨界值對照和陰性對照。在每次實驗時應(yīng)設(shè)置一個單一濃度水平的質(zhì)控品即弱陽性對照。這個弱陽性對照的值以設(shè)定在該試劑盒Cut-off值的2－3倍為宜。52外部對照質(zhì)控血清的來源和選擇1〕通過向有關(guān)機構(gòu)購置獲得2〕通過實驗室制備獲得(比較經(jīng)濟的方法)53制備外部對照的方法1.陽性血清2.陰性血清〔稀釋血清〕3.臨界值對照的OD/CO+2~3倍4.重復(fù)20次結(jié)果繪制質(zhì)控圖5.外部對照3000rpm15min去除沉淀，用0.2m生物濾膜過濾除菌后，56℃加熱30min滅活處理，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?4外部對照質(zhì)控血清的保存1〕外部對照血清或血漿的一次制備量應(yīng)該足夠本實驗室一年使用2〕外部對照血清應(yīng)該均一、無菌3〕外部對照血清標定后應(yīng)該等量分裝，每個分裝的量應(yīng)足夠一周使用4〕外部對照應(yīng)該分類作好標記5〕外部對照血清應(yīng)該存放在－70℃，如無條件那么存放在非自動除霜的－20℃冰箱6〕外部對照血清一旦融解以后應(yīng)該存放在2－8℃，一周后必須棄去，不能重新凍存。5520次外部對照的OD值56建立質(zhì)控圖參數(shù)①算術(shù)平均值(x)代表一組OD值數(shù)的平均值。②標準差(s);是描述樣品與均數(shù)之間離散程度的一個指標，是與對照質(zhì)控血清S/CO值均值有關(guān)的預(yù)期