大孔聚磷酸鈣殼聚糖復(fù)合材料的制備

骨是自然界最復(fù)雜、最有效的材料。而單一的無機(jī)材料和單一的有機(jī)材料都難以滿足臨床上對骨修復(fù)材料的生物活性及生物力學(xué)性能的綜合要求。所以,用于骨組織工程的材料,一般都是無機(jī)和有機(jī)的復(fù)合材料,它綜合了有機(jī)組分的韌性和無機(jī)組分的剛性,是具有綜合使用性能的骨修復(fù)復(fù)合材料。文獻(xiàn)上所報道的復(fù)合骨修復(fù)組織工程材料,通常是用生物活性陶瓷與合成高分子材料或天然高分子材料進(jìn)行復(fù)合。而用聚磷酸鈣(CPP)和殼聚糖(CS)復(fù)合用于骨修復(fù)材料的研究,迄今未見有文獻(xiàn)報道。無機(jī)陶瓷CPP具有生物相容性、生物活性、骨傳導(dǎo)性等優(yōu)點(diǎn),但是脆性、降解速率太慢,滿足不了骨修復(fù)的要求。有機(jī)成分CS是來源豐富的天然高分子材料,具有優(yōu)異的生物相容性和生物可降解性,可促進(jìn)成骨細(xì)胞在其表面黏附、分化和增值,但是其生物活性低,即缺乏與骨鍵合的生物活性,降解速率較快。將CPP和CS復(fù)合,可以取長補(bǔ)短,提高其力學(xué)性能和細(xì)胞相容性。為了增加CPP的韌性和提高其力學(xué)性能,本文用CS和CPP為原料,硬脂酸(Sad)為致孔劑,采用懸浮液熱分散復(fù)合法,用不同的工藝分別合成出了大孔復(fù)合材料棒材及微孔復(fù)合材料顆粒。用紅外光譜(IR)和掃描電鏡(SEM)研究了其化學(xué)結(jié)構(gòu)和形態(tài)結(jié)構(gòu),重點(diǎn)研究了2種工藝所得復(fù)合材料的力學(xué)性能和細(xì)胞相容性,發(fā)現(xiàn)材料的孔徑較大時,有利于細(xì)胞的生長和繁殖,復(fù)合材料中CPP含量增加時,細(xì)胞相容性增加,且力學(xué)性能增加。探索了不同工藝和不同配比對CPP/CS復(fù)合骨修復(fù)材料細(xì)胞相容性和力學(xué)性能的影響規(guī)律。這將為CPP/CS復(fù)合骨修復(fù)材料在臨床上的應(yīng)用提供研究依據(jù)。1實(shí)驗部分1.1實(shí)驗室和試劑殼聚糖:分子量分別為8.5、19.7、31.8、42、53.5、65萬,脫乙酰度分別為67.5%、71.34%、75.56%、78.23%、82.14%、85.46%、91.2%,食品級,由上?？ú┕べQ(mào)有限公司和青島海匯生物工程有限公司生產(chǎn);聚磷酸鈣:實(shí)驗室自行制備,粒徑為35、50、74、125、147、175、300μm;硬脂酸:分析純,粒徑范圍為50~300μm,成都科龍化工試劑廠;乙酸(HAC):分析純,成都科龍化工試劑廠;無水乙醇:分析純,含量為99.7%,成都科龍化工試劑廠;氫氧化鈉:分析純,成都科龍化工試劑廠;乙醚:分析純,成都科龍化工試劑廠;透析袋:截留分子量10000,天泰試劑公司。1.2cpp-cs材料的合成1.2.1復(fù)合懸液的制備在250mL的三頸瓶中加入4.00gCS粉末和6.70gSad顆粒的混合料,加入96.00g2vol%HAC溶液,在65℃攪拌溶解1h。用10mL無水乙醇攪拌分散6.00gCPP,加入三頸瓶中再攪拌3h。將復(fù)合懸液裝入透析袋,放入5wt%NaOH溶液中浸泡24h。蒸餾水漂洗至中性,分別用乙醚和乙醇浸溶出Sad,再用蒸餾水漂洗12h后室溫晾干。1.2.2cpp復(fù)合懸液的制備在250mL的三頸瓶中加入4.00gCS粉末,再加入96.00g2vol%HAC溶液,在65℃攪拌溶解1h。用10mL無水乙醇攪拌分散6.00gCPP,加入三頸瓶中再攪拌3h。將復(fù)合懸液滴入5%NaOH溶液中浸泡24h。蒸餾水漂洗至中性后室溫晾干。1.3孔徑及孔隙率在美國尼高力儀器公司生產(chǎn)的Nicolet520型傅里葉變換紅外光譜儀上測定復(fù)合材料的IR譜。用日本電子公司生產(chǎn)的JSM-5900LV型掃描電子顯微鏡觀察并拍攝復(fù)合材料斷面的形態(tài)照片,測定復(fù)合材料的孔徑。用乙醇滲透法測定CPP/CS多孔復(fù)合材料的孔隙率。將樣品制成直徑相同、高度相同的圓柱體,在美國INSTRON公司生產(chǎn)的4302型萬能材料實(shí)驗機(jī)上測定壓縮強(qiáng)度。1.4本材料對細(xì)胞的適應(yīng)性試驗1.4.1細(xì)胞免疫酶活性測定材料稱重,密封后經(jīng)γ射線滅菌,以每1g樣品加入10mL細(xì)胞培養(yǎng)液,在37℃,5vol%CO2無菌條件下浸提72h作為浸提液。將細(xì)胞密度為1×104個/mL的內(nèi)皮細(xì)胞懸液,接種96孔板,每孔200μL,置于37℃±2℃,5vol%CO2培養(yǎng)箱中開放培養(yǎng)24h,使細(xì)胞貼壁。棄去培養(yǎng)液,加入等量的浸提液,再放入37℃±2℃,5vol%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)2、4、6天。在各觀察期(2、4、7天),棄去培養(yǎng)皿內(nèi)的浸提液和培養(yǎng)液,加入20μL/孔的噻唑藍(lán)(MTT)液,繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸去原液,加入150μL/孔二甲基亞砜(DMSO),震蕩10min,在免疫酶標(biāo)儀上以490nm波長測定吸光度值。細(xì)胞的相對增殖度(RGR)按下式計算:RGR=實(shí)驗組平均吸光度值陰性對照組平均吸光度值×100%RGR=實(shí)驗組平均吸光度值陰性對照組平均吸光度值×100%1.4.2細(xì)胞生長特性的測定將材料置于24孔板中,將成骨細(xì)胞懸液(濃度為5×104個/mL,DMEM培養(yǎng)液中含10wt%小牛血清)用微量加樣器接種于24孔培養(yǎng)板上,每孔2000μL細(xì)胞懸液。置于37℃±2℃,5vol%CO2培養(yǎng)箱中開放培養(yǎng)7天,于第6天用微量移液槍吸出1mL培養(yǎng)液再加入新鮮培養(yǎng)基1mL。在此期間采用倒置相差顯微鏡給樣品拍照以觀察細(xì)胞在材料上的生長情況。固定:將細(xì)胞與支架材料復(fù)合培養(yǎng)到預(yù)定時間后,從孔板中取出材料,采用磷酸緩沖溶液(PBS)漂洗2遍后,放入青霉素小瓶中,加入4℃預(yù)冷的3wt%戊二醛,在4℃固定2h或過夜,吸出固定液,用PBS浸洗2次,每次10min。脫水:用系列質(zhì)量濃度的梯度酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%)脫水,每種濃度酒精通過2次,每次15min。干燥:采用臨界點(diǎn)干燥法干燥,真空噴金后放入掃描電子顯微鏡觀察。2結(jié)果與討論2.1氫鍵生成分析從圖1可知,在復(fù)合材料的圖譜中,沒有722.48cm-1和549.34cm-1硬脂酸的基團(tuán)吸收峰和—COOH的吸收峰,說明復(fù)合材料中的Sad已經(jīng)全部溶出了。在3000cm-1有一個肩峰,表明有氫鍵的存在,說明CS的氨基和CPP的Ρ=Ο基生成了氫鍵,這也是復(fù)合材料緊密且有強(qiáng)度的原因。微孔復(fù)合材料顆粒的FTIR與此相同。圖2(a)是CPP/CS大孔復(fù)合材料棒材的SEM照片,通過SEM分析,觀測了大孔復(fù)合材料棒材的孔徑和形態(tài)結(jié)構(gòu),其孔徑范圍為50~300μm,形態(tài)結(jié)構(gòu)致密均勻;用乙醇滲透法測定材料的孔隙率為71.13%,滿足組織工程骨修復(fù)材料對孔徑和孔隙率的要求。圖2(b)是CPP/CS微孔復(fù)合材料顆粒的SEM照片。通過SEM觀測到微孔復(fù)合材料顆粒的孔徑范圍為10~100μm,測定出其孔隙率為40.76%,形態(tài)結(jié)構(gòu)致密均勻。2.2原料配比對復(fù)合材料細(xì)度的影響用分子量為42萬、脫乙酰度為75.56%的CS,用粒徑為50μm的CPP,按不同的質(zhì)量配比合成出復(fù)合材料,其壓縮強(qiáng)度與CPP含量的關(guān)系見圖3。由圖可見,CPP與CS復(fù)合可以提高CPP的壓縮強(qiáng)度,原料配比為CPP/CS=5/5、6/4、7/3時,復(fù)合材料的強(qiáng)度較高,而當(dāng)CPP/CS=7/3時,強(qiáng)度最高,說明接近人體骨中無機(jī)/有機(jī)的質(zhì)量比例時性能最好。大孔復(fù)合材料棒材比微孔復(fù)合材料顆粒的壓縮強(qiáng)度高,因為棒材是在透析袋中,沉析很緊密,強(qiáng)度高;而顆粒是在NaOH溶液中浸泡,較疏松,強(qiáng)度低。2.3材料的細(xì)胞兼容性2.3.1大孔復(fù)合材料棒材細(xì)胞透氣性分析圖4是不同配比的復(fù)合材料培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線及陰性對照曲線。從曲線可以看出,無論是大孔復(fù)合材料棒材,還是微孔復(fù)合材料顆粒,配比為CPP/CS=7/3時的復(fù)合材料的細(xì)胞相容性均較好。從圖4可知,大孔復(fù)合材料棒材的細(xì)胞相容性比微孔復(fù)合材料顆粒的細(xì)胞相容性好,其原因是大孔復(fù)合材料棒材的空隙較大,其中的雜質(zhì)等小分子物質(zhì)容易被蒸餾水漂洗除去;而微孔復(fù)合材料顆粒的空隙較小,其中的雜質(zhì)等小分子物質(zhì)不容易被蒸餾水漂洗除去,對細(xì)胞的生長有一定影響。復(fù)合材料的細(xì)胞相容性不如單一材料好,這可能是復(fù)合材料經(jīng)過復(fù)合、沉析、漂洗等步驟會引入雜質(zhì)的緣故。2.3.2料棒材與復(fù)合材料的rgr比對表1為不同配比復(fù)合材料棒材和顆粒樣品的RGR值。從表1可知,復(fù)合材料棒材的RGR值都比復(fù)合材料顆粒的高,且CPP/CS=7/3時的復(fù)合材料的RGR比其他配比的高。再次說明棒材的細(xì)胞相容性比顆粒的好,當(dāng)復(fù)合材料的配比為CPP/CS=7/3時,復(fù)合材料的細(xì)胞相容性最好。2.3.3大孔復(fù)合材料的生長用分子量為42萬、脫乙酰度為75.56%的CS,和粒徑為50μm的CPP,按質(zhì)量配比為CPP/CS=7/3合成出大孔復(fù)合材料棒材及微孔復(fù)合材料顆粒。成骨細(xì)胞在材料上生長的SEM照片如圖5所示。從圖5所知,成骨細(xì)胞在大孔復(fù)合材料棒材上生長情況良好,而在微孔復(fù)合材料顆粒上幾乎不能生長。這是因為后者的空隙太小,不能提供成骨細(xì)胞生長的足夠大的空間,即不利于細(xì)胞的生長。3懸浮液熱分散法ftir分析(1)所合成的CPP/CS大孔復(fù)合材料棒材,具有均勻密集的大孔,孔徑范圍為50~300μm,孔隙率為71.13%,適合骨修復(fù)材料對孔徑和孔隙率的要求。(2)從SEM照片可以看出,CS和CPP在復(fù)合材料中的分布是均勻的;從FTIR