注射高濃度菌液大鼠重癥肺炎模型的建立

重癥肺炎是呼吸衰竭的常見臨床疾病。成功的動物模型對該病的發(fā)病機制和臨床研究具有重要意義。但文獻報道的重癥肺炎動物模型很少,有Sprague-Dawley(SD)大鼠模型,也有Piglet小豬模型;而且都存在一定缺陷,前者不能對患病大鼠進行實時大鼠血氧情況監(jiān)測,后者實驗過程復(fù)雜,設(shè)備要求高等。本研究擬在原報道的SD大鼠模型的基礎(chǔ)上進行改良,采用無創(chuàng)動脈血氧飽和度儀監(jiān)測大鼠血氧飽和度(oxygensaturation,SaO2)情況,尋求更為理想的重癥肺炎動物模型,并提出重癥肺炎動物模型的診斷標(biāo)準(zhǔn)。材料和方法1材料表面1.1細(xì)菌培養(yǎng)和培養(yǎng)肺炎克雷伯桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC700603)由廣州市第一人民醫(yī)院檢驗科細(xì)菌室提供。實驗前1d將菌株接種于羊血瓊脂糖平板上,于CO2恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)18~24h后,收集細(xì)菌。根據(jù)比濁法,用無菌生理鹽水將其稀釋成含菌量400個麥?zhǔn)蠞岫葐挝?相當(dāng)于1.2×1014CFU/L,1個麥?zhǔn)蠞岫葐挝?3×1011CFU/L)和3個麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏幕鞈乙簜溆谩?.2儀器、試劑和儀器生物梅里埃細(xì)菌比濁計(法國生物梅里埃公司);邁瑞PM-50掌式血氧飽和度監(jiān)測儀,邁瑞新生兒包裹血氧傳感器518B64-4(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司);i-STAT(300型)血氣分析儀(美國雅培公司);T1800血球分析儀(日本東亞公司);鄭州豪潤奇HRQ-A2獸用電子體溫計;美國INNOVETE7239X獸用X光機,德國PROTECPROSCAN35CR機(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院提供)。2方法2.1模型組和對照組的選擇健康SPF級雄性SD大鼠25只,鼠齡為6~8周,體重180~200g,由廣東省實驗動物中心提供[使用許可證號為SCXK(粵)2008-0002,合格證編號No.0100760]。隨機分為對照組、觀察組和模型組,對照組和觀察組各5只,模型組15只。不同組別,分籠飼養(yǎng)于廣州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心恒溫(25℃)房間內(nèi),光照和黑暗各12h交替,自由進食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及飲水,適應(yīng)環(huán)境7d。2.2模型組的制作腹腔注射10%水合氯醛(3mL/kg)麻醉,麻醉后固定,頸部備皮消毒,無菌操作,切開頸部皮膚,暴露上段氣管,用24G的Y型靜脈留置針經(jīng)氣管插管,拔出針芯,使導(dǎo)管完全進入氣管,由留置針白色帽端處注入。模型組注入含菌量為400個麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏募?xì)菌混懸液0.35mL,將固定大鼠的手術(shù)臺豎立起來后緩慢注射,每注射0.1mL后豎立大鼠,左右旋轉(zhuǎn)大鼠固定臺1min后再繼續(xù)。觀察組和對照組分別以相同方法注入含菌量為3個麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏募?xì)菌混懸液0.35mL和等量的無菌生理鹽水。接種完后繼續(xù)豎立大鼠固定臺,使大鼠先后分別保持直立位和倒立位各約2min,盡量使菌液均勻分布于雙肺各個肺葉?？p合傷口,局部消毒。2.4觀察組的后續(xù)觀察術(shù)后24h內(nèi)死亡的排除出實驗,并被重新注菌的大鼠替代入組,進行后續(xù)觀察。對照組和觀察組于術(shù)后72h時,模型組在達到預(yù)定的診斷標(biāo)準(zhǔn)后,腹腔注射10%水合氯醛(3mL/kg)麻醉后,脊椎脫臼法處死大鼠。2.5相關(guān)觀察指標(biāo)2.5.1形態(tài)觀察,當(dāng)尿量、糞便、嘴唇有異常觀察大鼠反應(yīng)情況,是否豎毛、嗜睡,觀察尿量和糞便變化,觀察鼻腔及眼眶有無分泌物、有無氣促,有無喘鳴音,觀察肢端皮膚顏色變化等。2.5.2體重變化監(jiān)測術(shù)前3d及術(shù)后每天固定于早上8點鐘測量大鼠體重變化,處死大鼠之前再一次記錄大鼠體重。2.5.3小鼠用獸溫計術(shù)前3d及術(shù)后每6h監(jiān)測大鼠體溫和SaO2。探測體溫時,操作時讓大鼠盡可能處于自然狀態(tài),避免過于緊張,恐懼,用獸用電子體溫計軟頭部位插入直腸約5~8cm。連續(xù)讀數(shù)3次后,取其平均值;測SaO2變化時,將動脈血氧飽和度儀傳感器包裹在大鼠右后肢膝關(guān)節(jié)以上腿部(剃去毛發(fā)),每次監(jiān)測3min,取讀數(shù)穩(wěn)定≥30s的值記錄為實測SaO2值。2.5.4血常規(guī)分析檢測所有大鼠分別于術(shù)后的第24h和處死前眼眶后靜脈叢取血,每次約收集0.1mL行血常規(guī)分析,觀察白細(xì)胞計數(shù),中性粒細(xì)胞計數(shù)百分比。2.5.5動脈血氣分析所有大鼠在處死前,麻醉后無菌操作分離腹主動脈,結(jié)扎動脈遠(yuǎn)端,取血約1mL后立即用血氣分析儀進行血氣分析。2.5.6氣管、血管和肺實驗結(jié)束時,麻醉后處死所有大鼠,完整取下雙側(cè)肺組織,觀察肺組織大體變化情況。沿著氣管、血管走向,將其切成5~10mm厚的小塊,保證肉眼可辨別支氣管、血管和肺實質(zhì);參考肺炎評分標(biāo)準(zhǔn),進行肺組織大體病理學(xué)評分,0分:肺部沒有炎癥出現(xiàn);1分:支氣管出現(xiàn)膿性黏液栓,未出現(xiàn)管壁破壞;2分:支氣管炎,表現(xiàn)為膿性黏液栓并出現(xiàn)支氣管破壞;3分:肺炎,指次級肺段出現(xiàn)實變;4分:融合性肺炎,表現(xiàn)為相鄰幾個次級肺段出現(xiàn)實變;5分:化膿性肺炎,肺實變灶有膿性壞死物溢出。留取病灶較明顯的組織于4%甲醛溶液充分固定24h后,常規(guī)脫水、透明、包埋、切片,蘇木精-伊紅(HE)染色后,病理顯微鏡下觀察組織變化。2.5.7乳房x線檢查術(shù)后處死前隨機抓取對照組和觀察組鼠各2只,進行胸部X線檢查。模型組大鼠在無創(chuàng)血氧飽和度儀測得數(shù)值小于90%時進行。3數(shù)據(jù)處理和分析采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理,各組數(shù)據(jù)在分析前進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗,正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)表示。兩組均數(shù)比較采用t檢驗,多組均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩樣本相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析;以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1發(fā)死期及死亡率模型組1只在注菌過程中死亡;2只在注菌術(shù)后12h突然死亡;這3只后來重新注菌后補做。15只大鼠存活時間>24h,在術(shù)后30~36h及36~42h分別自發(fā)死亡1只,42~48h和48~54h之間各有2只自發(fā)死亡;其余9只大鼠分別在36h時處死2只,42h時處死1只,48h處死3只,54h處死1只,66h處死2只。對照組和觀察組大鼠在實驗期間未出現(xiàn)自發(fā)死亡現(xiàn)象。2大鼠生理情況觀察模型組大鼠在注菌后的前24h,活動明顯減弱,蜷縮于鼠籠一側(cè),反應(yīng)遲鈍,鼻腔和眼眶周邊可見少許分泌物,偶見豎毛,呼吸急促,雙側(cè)胸廓呼吸動度增強,無發(fā)紺,鼠籠中糞便少,墊料干潔。24~48h,出現(xiàn)大鼠死亡,存活者出現(xiàn)嗜睡,體型較前瘦小,鼻腔及眼眶分泌物增多,呼吸急促情況較前明顯,有些能聞及喘鳴音,偶可見大鼠排稀爛樣便;第48h后,存活大鼠眼眶和鼻腔分泌物減少,呼吸急促,有喘鳴音,可見大鼠四肢及陰囊出現(xiàn)紫紺,豎毛明顯,觸摸之覺背部肌肉松垮。觀察組在前24h,可見大鼠活動及進食減少、蜷縮,呼吸頻率增多等,但逐漸好轉(zhuǎn),到72h處死前,未見明顯行為學(xué)異常;對照組活動自如,反應(yīng)靈敏,無氣促,無喘鳴音,無異常分泌物,無嗜睡,大便形狀正常。3大鼠體重、注菌前下降術(shù)前3組大鼠體重?zé)o降低,每天增加(5±3)g,術(shù)前3d共增加(20±5)g。模型組術(shù)后第1d下降明顯,約下降(12±3)g,存活大鼠第2、3d體重下降減緩,為(6±2)g;處死時體重較注菌前下降(25±5)g。觀察組術(shù)后1d體重基本不變,處死前約增加(10±3)g。對照組體重變化趨勢如術(shù)前。處死前各組進行體重比較,均有顯著差異(P<0.05)。4各組大鼠進行充菌后2h模型模型模型檢測術(shù)前3組大鼠體溫?zé)o明顯差異(P>0.05),波動于(37.8±0.5)℃。術(shù)后6h即開始出現(xiàn)體溫下降,模型組為(34.5±0.5)℃,觀察組(34.7±0.3)℃,對照組為(35.2±0.8)℃,爾后3組大鼠體溫逐漸回升,注菌后24h,模型組(36.7±1.0)℃,觀察組(36.9±0.7)℃,對照組(37.8±0.5)℃之間,觀察組和模型組比較,未見明顯差異(P>0.05),觀察組、模型組與對照組相比,可見顯著差異(P<0.05)。處死前各組體溫為:模型組(37.7±0.5)℃,觀察組(37.9±0.4)℃,對照組(38.0±0.5)℃,3組大鼠組間比較,均未見明顯差異(P>0.05)見圖1。5大鼠sao2的變化術(shù)前3組大鼠無創(chuàng)方法測得SaO2無明顯差異(P>0.05),波動在(94~100)%之間。模型組在注菌后的24h內(nèi),無明顯下降;術(shù)后第24h開始下降,為(91±3)%。術(shù)后第36~66h之間,模型組大鼠陸續(xù)出現(xiàn)SaO2明顯下降,波動于(83.5±3.5)%。對照組及觀察組手術(shù)前后無明顯變化(P>0.05);模型組分別與觀察組和對照組進行比較,均有顯著差異(P<0.05)。6兩組術(shù)后第24h和致死時細(xì)胞計數(shù)、中性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的變化對照組觀察不同時點,血常規(guī)觀察指標(biāo)未見明顯差異(P>0.05)。觀察組和模型組在術(shù)后第24h和處死時白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)逐漸升高,尤以模型組變化明顯;觀察組、模型組分別與對照組比較,均有顯著差異(P<0.05);觀察組和模型組組間、不同時點比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。7氧飽和度、動脈血氧分壓和二氧化碳分壓與對照組和觀察組相比,模型組在術(shù)后處死前動脈血氧飽和度、動脈血氧分壓和二氧化碳分壓下降明顯,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);觀察組和對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。8pearson相關(guān)系數(shù)血氧飽和度儀讀數(shù)和動脈血氣分析中血氧飽和度值呈線性趨勢,Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.977(P<0.01),具有統(tǒng)計學(xué)意義。兩者幾乎表達于同一線上,見圖2。9大鼠雙側(cè)肺病理及形態(tài)觀察對照組大鼠胸片無明顯異常,雙肺肺紋理清晰,無增粗,未見實變影,未見浸潤陰影,雙側(cè)肺門清晰,雙側(cè)肋隔角銳利,雙側(cè)膈面光滑低平;觀察組大鼠雙肺透亮度減低,肺紋理稍粗亂,雙肺散在少量小斑片影,邊界稍模糊;模型組大鼠見雙肺透亮度劇降,雙下肺可見散在斑片狀模糊影,整個肺野為“大白肺”,見圖3。10大鼠肺組織形態(tài)變化肺組織大體如圖4:對照組雙側(cè)肺組織表面光滑,顏色粉紅,無出血點,無浸潤灶,質(zhì)地軟嫩,彈性良好;觀察組大部分肺組織光滑,偶見小片實變灶,包膜有充血,未見化膿灶;模型組雙側(cè)肺組織不同肺葉均出現(xiàn)散在的出血點,肺包膜下充血明顯,肺組織呈暗紅色,有大片實變灶,甚至可見化膿灶,肺組織彈性差,觸摸之有實質(zhì)感;肺組織大體評分:每只大鼠有5個肺葉(左側(cè)1個,右側(cè)4個),根據(jù)肺炎分級標(biāo)準(zhǔn),對每個肺葉進行評分。其中,模型組大鼠多個肺葉達到3分及以上改變,具體見表3。肺組織病理切片HE染色,鏡下見對照組大鼠肺組織形態(tài)正常,肺泡結(jié)構(gòu)完整,肺泡腔內(nèi)無炎性滲出物浸潤,肺泡間質(zhì)無充血,水腫;觀察組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)不一,肺泡間隔增寬、斷裂,肺泡間隔內(nèi)血管充血,可見紅細(xì)胞和炎癥細(xì)胞浸潤;模型組大鼠僅見少量完整肺泡,余肺泡結(jié)構(gòu)破壞,腔內(nèi)見漿液性滲出物,少量紅細(xì)胞,大量中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞浸潤,甚至肺泡腔完全實變,見圖5。應(yīng)重視的問題重癥肺炎是呼吸科臨床常見的危重癥疾患,除外肺炎常見的呼吸系統(tǒng)臨床表現(xiàn)外,常伴有急性呼吸衰竭、嚴(yán)重的中毒癥狀和(或)膿毒性休克,甚至多器官功能衰竭綜合征等危及生命的并發(fā)癥。盡管近年來醫(yī)療設(shè)備和搶救技術(shù)水平不斷提高,許多廣譜、高效抗生素相繼問世,其臨床治療效果仍不理想,在重癥監(jiān)護病房的死亡率在28%~50%之間,并沒有下降的趨勢。故重癥肺炎動物模型的成功制備對該病發(fā)病機制和臨床研究有重要意義。然而,國內(nèi)外關(guān)于重癥肺炎動物模型建立的文章較少。陳業(yè)民等于2005年建立了肺炎克雷伯桿菌重癥肺炎動物模型。該模型中將濃度為3個麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏姆窝卓死撞畻U菌懸液,通過暴露氣管、穿刺氣管注射的方式注入肺內(nèi),于注菌后第5、6d模型建立成功。而國外學(xué)者Luna等于2007年利用Piglet小豬建立了第一個銅綠假單胞菌重癥肺炎模型。該模型是模擬呼吸機獲得性肺炎模型改良的,需要在配備有心血管監(jiān)視器、呼吸機、電子輸注泵的重癥監(jiān)護實驗室進行,對小豬行氣管插管,股動、靜脈插管和膀胱插管等,通過支氣管纖維內(nèi)窺鏡把銅綠假單胞菌懸液均勻地分布到雙肺的各個肺葉中,實驗過程中需要為實驗小豬提供24h的照顧。這2個模型雖然都得到一些應(yīng)用,但仍有較多不足。前者在模型的建立過程中,大鼠發(fā)病較慢,且未見有大鼠死亡的報道,這與臨床上重癥肺炎患者的病情快速變化和高死亡率并不相符;并且需通過有創(chuàng)暴露腹主動脈或頸內(nèi)動脈取血來監(jiān)測血氧飽和度變化,導(dǎo)致大鼠死亡,對后續(xù)的實驗觀察帶來不便;后者實驗雖然較為精細(xì),但設(shè)備要求高,操作繁瑣,況且該模型一開始即給予呼吸機通氣支持,與臨床上重癥肺炎發(fā)病相悖,對重癥肺炎的發(fā)病機制研究將產(chǎn)生一定的影響。因此,探討建立病情發(fā)展較快,更接近臨床重癥肺炎患者的大鼠模型和更為簡單的模型診斷標(biāo)準(zhǔn),尤為重要。在預(yù)實驗中,我們對細(xì)菌濃度、用量和注菌方式進行深入探索,最終確定濃度為400個麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏募?xì)菌懸液0.35mL對6~8周的200g左右的SD大鼠是比較理想的:既不會因為菌液過少,導(dǎo)致大鼠對感染的耐受;也不會因為濃度過高,導(dǎo)致菌液黏稠,堵塞呼吸道,造成模型大鼠術(shù)中死亡。注菌時,通過旋轉(zhuǎn)、交替豎立和倒立大鼠手術(shù)固定臺的方法,可以使菌液較均勻地分布到各個肺葉。通過用24G的Y型靜脈留置針經(jīng)氣管插管,拔出針芯,使導(dǎo)管完全進入氣管后注菌的方法,可以避免普通的1mL注射器穿透氣管,造成菌液外露;而且導(dǎo)管更深入地進入氣管,菌液可以快速達到肺氣管,避免菌液堵塞下段氣管,造成大鼠窒息。另一方面,我們也探討了無創(chuàng)動脈血氧飽和度儀監(jiān)測大鼠動脈血氧飽和度的方法,并證明其跟有創(chuàng)的動脈血氣分析所得到的血氧飽和度具有高度的一致性,可用于監(jiān)測大鼠動脈血氧飽和度。但因為大鼠體表毛發(fā)和肢端形體較不規(guī)則,可能會對血氧飽和度儀傳感器的敏感性產(chǎn)生一定的影響。因此,測量的時候,需要對毛發(fā)進行處理,并選擇敏感性較強的傳感器,而且要等到血氧飽和度儀器讀數(shù)較穩(wěn)定后才能取值記錄。實驗中,我們通過連續(xù)對3組大鼠無創(chuàng)監(jiān)測血氧飽和度,當(dāng)出現(xiàn)SaO2<90%時,觀察其神智反應(yīng)、呼吸頻率和胸部X線變化。如果都達到預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn),則認(rèn)為該大鼠建模成功,立即處死建模成功大鼠,研究其血常規(guī),血氣變化和病理組織變化。在實驗觀察周期內(nèi),對照組和觀察組大鼠無一出現(xiàn)SaO2<90%。而模型組大鼠在不同的時點內(nèi)達到建模成功的標(biāo)準(zhǔn),最快在注菌后的36h出現(xiàn),最遲在66h建模成功,有6只大鼠出現(xiàn)自發(fā)死亡,自發(fā)死亡率為40%。與對照組和觀察組相比,模型組大鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、呆滯等神智變化;鼻腔和眼眶出現(xiàn)分泌物,呼吸急促,四肢及陰囊部位出現(xiàn)紫紺,尿量、糞便減少,體重明顯減輕,可能與重癥肺炎大鼠肺部感染后出現(xiàn)的呼吸衰竭和并發(fā)的腎功能損害、消化道功能紊亂有關(guān)。術(shù)后24h和處死前血常規(guī)檢查中,模型組白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞計數(shù)及其百分?jǐn)?shù)升高較為明顯,這與我們前面對重癥肺炎患者的研究結(jié)果相一致。處死前動脈血氣分析示大鼠處于呼吸衰竭狀態(tài),血氧飽和度值與無創(chuàng)血氧飽和度儀讀數(shù)相一致。組織病理學(xué)方面,肺組織大體表現(xiàn)為雙側(cè)多個肺葉出現(xiàn)大片實變灶,甚至出現(xiàn)化膿性病灶,與臨床