淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌-聚賴氨酸的質(zhì)量分析

0-聚賴氨酸作為食品添加劑的使用你是用氨基丙烯酸（氨基丙烯酸）和氨基酸（氨基丙烯酸）一起提取的。這是由白色鏈菌產(chǎn)生的天然聚氨基酸。這些物質(zhì)是由25.35個(gè)氨基酸-結(jié)合產(chǎn)生的。氨基酸。ε-聚賴氨酸抑菌譜廣,抑菌作用強(qiáng),在中性和微酸性環(huán)境中,對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、霉菌都有一定的抑菌效果,而且其對耐熱性芽孢桿菌和一些病毒也有抑制作用。此外,ε-聚賴氨酸熱穩(wěn)定好,安全性高。因此作為防腐劑使用具有非常廣闊的前景。在日本,ε-聚賴氨酸已經(jīng)被允許作為食品防腐劑使用多年,其應(yīng)用領(lǐng)域包括肉制品、快餐食品、蛋糕,面點(diǎn)類食品等。韓國也允許其作為食品添加劑使用。美國FDA于2003年10月正式批準(zhǔn)(GRASNoticeNo.GRN000135.)ε-聚賴氨酸作為天然食品防腐劑使用。目前,ε-聚賴氨酸在中國還未被批準(zhǔn)使用,其相應(yīng)的質(zhì)量檢測指標(biāo)和方法也未建立。為此,本文在參照日本和韓國關(guān)于ε-聚賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上,探討了ε-聚賴氨酸樣品的檢測方法以及其質(zhì)量分析,為這一產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的確立提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。1材料和方法1.1高效液相色譜儀器ε-聚賴氨酸(ε-PL)(浙江銀象生物工程有限公司);消化爐KDN-08C(上海倫升科貿(mào)有限公司儀器);Agilent1100高效液相色譜(美國Agilent公司);原子吸收分光光度計(jì)AA600(美國尢尼科儀器有限公司);馬弗爐(天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司)。1.2樣品的預(yù)處理稱取一定量的ε-聚賴氨酸于預(yù)先干燥好的培養(yǎng)品當(dāng)中,在烘箱中105℃下烘干3h左右,直至樣品恒重,備用。1.3-證明聚氧氨酸中氯含量的方法1.3.1agno3標(biāo)準(zhǔn)具體過程如下:準(zhǔn)確稱取一定量ε-聚賴氨酸試樣,用蒸餾水(不含氯離子)定溶到100mL。用移液管吸取試液25mL于250mL三角瓶中,加入25mL蒸餾水及HNO35mL,采用標(biāo)定過的0.1000mol/LAgNO3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至沉淀完全,然后再加入適當(dāng)過量的AgNO3標(biāo)準(zhǔn)溶液5～10mL,將溶液加熱煮沸,使AgCl沉淀凝聚以減少AgCl沉淀對Ag+的吸附、過濾,并用HNO3洗滌沉淀,洗滌液并入濾液中。然后加入鐵銨礬指示劑1mL,再用經(jīng)標(biāo)定過的0.1000mol/L硫氰酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液回滴濾液中過量的AgNO3至淡紅色即為終點(diǎn)。記下消耗的AgNO3和硫氰酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,計(jì)算樣品所帶氯元素的含量,計(jì)算公式請參考文獻(xiàn)(7)。1.3.2加標(biāo)回收率的測定稱取已測知氯含量的ε-聚賴氨酸于250mL錐形瓶中,分別加入25mL蒸餾水及HNO35mL,然后加入20mL0.1mol/L的NaCl標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.3.1過程進(jìn)行操作,根據(jù)硫氰酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗量推算出樣品的回收率,回收率=(實(shí)際測出樣品中總的氯元素的量)/(已知樣品中氯元素的量+添加的氯元素的量)×100%。1.4-多酚酸含量檢測方法1.4.1標(biāo)準(zhǔn)鹽酸純度的計(jì)算采用常規(guī)的凱氏定氮方法,詳細(xì)步驟參照GB5009.5—85,其中ε-聚賴氨酸的樣品量為0.2～0.5g固體樣品,加入0.2g硫酸銅,6g硫酸鉀及20mL硫酸,消化時(shí)間為6～8h。滴定所采用的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的濃度為0.05mol/L。純度的計(jì)算按如下方程計(jì)算:X=(V1?V2)×N×0.014m×10100×F×100X=(V1-V2)×Ν×0.014m×10100×F×100X——樣品中蛋白質(zhì)的含量,%;V1——樣品消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積,mL;V2——試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積,mL;N——硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的當(dāng)量濃度;0.014——1N硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL相當(dāng)于氮克數(shù);m——樣品的質(zhì)量(體積),g(mL);F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù),其中ε-聚賴氨酸的換算系數(shù)為5.24。1.4.2檢測波長和流動相的確定色譜條件為:色譜柱為TSKgelODS-120T,Φ4.6mm×25cm。檢測器為紫外分光光度計(jì),檢測波長為215nm。柱溫40℃。流動相為磷酸氫二鉀1.7g和硫酸鈉1.42g溶于800mL水中,用磷酸調(diào)pH至3.4后用水定容至1000mL。之后取此溶液920mL加入80mL乙腈。采用L-苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo),進(jìn)樣量為20uL。1.5測定鉛含量采用原子吸收的方法測定重金屬鉛的含量。其具體方法參照GB/T5009.12-2003,食品中鉛的測定。2結(jié)果與討論2.1烘干前后質(zhì)量變化將ε-聚賴氨酸樣品在烘箱中105℃下烘干,烘干前后質(zhì)量變化如表1。在日本和韓國標(biāo)準(zhǔn)中,樣品經(jīng)105℃下烘干3h,水分的損失不得大于20%,可以得出本樣品符合日本和韓國的標(biāo)準(zhǔn)。2.2-聚賴氨酸的配比ε-聚賴氨酸含有多個(gè)游離的氨基,通常從發(fā)酵液分離純化后得到的主要為鹽酸鹽。采用佛爾哈德法對其氯元素含量進(jìn)行測定。在酸性條件下加入過量硝酸銀溶液使樣品溶液中的氯離子形成氯化銀沉淀,用硫氰酸銨回滴過量的硝酸銀,根據(jù)消耗的硫氰酸銨的量,計(jì)算出其所帶鹽酸的量,指示劑為硫酸鐵銨。ε-聚賴氨酸中氯元素的含量測定結(jié)果如表2所示。計(jì)算ε-聚賴氨酸與氯元素的配比過程為:L-賴氨酸單體物質(zhì)的量=樣品的質(zhì)量×相應(yīng)的凱氏定氮所得出的氮含量/2×14,配比即為L-賴氨酸單體物質(zhì)的量與氯元素的物質(zhì)的量比值。根據(jù)參考文獻(xiàn)的ε-聚賴氨酸的1H核磁共振的結(jié)果和紅外光譜圖,加上上面的配比結(jié)果?？芍?ε-聚賴氨酸鹽酸鹽的結(jié)構(gòu)式可如下表示:按平均聚合度n=30來算的話,根據(jù)上面的結(jié)構(gòu)式可以得出ε-聚賴氨酸與ε-聚賴氨酸鹽酸鹽的比例大約為0.7781∶1,與日本標(biāo)準(zhǔn)基本一致,此比例可用于下面純度的換算。通過往樣品中加入已知量的Cl-,然后再進(jìn)行含量測定,考察了氯元素滴定的回收率,其結(jié)果見表4。三次測定結(jié)果回收率在99%～101%之間,說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。2.3-多酚酸含量的測量2.3.1采用硅氮法測定了聚氨酸含量凱氏定氮法測定樣品中ε-聚賴氨酸含量結(jié)果見表5。2.3.2凱氏定氮與液相的定量方法上圖中ε-聚賴氨酸濃度為1.2g/L時(shí),L-苯丙氨酸做為內(nèi)標(biāo)物.其中ε-聚賴氨酸的保留時(shí)間為4.539min,L-苯丙氨酸的保留時(shí)間為9.795min,能夠很好的分離,并且峰型窄而高,可以很好的用于定量,其他濃度的液相圖類似。通過本實(shí)驗(yàn)室自制ε-聚賴氨酸純品作為標(biāo)品,L-苯丙氨酸為內(nèi)標(biāo)物,所得的ε-聚賴氨酸濃度和峰面積的線性關(guān)系為y=0.017x-0.01374(數(shù)據(jù)未列出),其中x為峰面積,y為ε-聚賴氨酸的樣品濃度(g/L)。通過對比凱氏定氮和液相的方法比較,可以發(fā)現(xiàn)兩者結(jié)果基本一致,但在實(shí)際過程當(dāng)中,液相的操作方法簡便,而且便于處理大量樣品,凱氏定氮的方法過程繁瑣,影響因素較多,結(jié)果的重現(xiàn)性比液相差。所以,高效液相的方法是一種可行而且便于推廣的方法。2.4未檢測樣品的測定采用原子吸收法測定樣品中鉛含量,在含鉛量1.0025ppb為檢出下限的前提下,未檢測出樣品中有鉛的存在,其中標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.00607+0.007022X,R2=0.9982(數(shù)據(jù)未列出)。3樣品的檢測結(jié)果本論文從微生物發(fā)酵產(chǎn)的ε-聚賴氨酸樣品為出發(fā)點(diǎn),對其氯元素含量,純度,重金屬含量等對其進(jìn)行了測定。通過佛爾哈德法測量了ε-聚賴氨酸鹽酸鹽中氯元素的含量,并由其結(jié)果得出了聚賴氨酸游離的測量氨基上所帶氯元素的量,據(jù)此確定了ε-聚賴氨酸與ε-聚賴氨酸鹽酸鹽的比例。通過凱氏定氮法和高