第二章組織學(xué)根底

第一節(jié)組織學(xué)技術(shù)簡介

IntroductionofHistology組織的概念形態(tài)相似、功能相近的細(xì)胞與細(xì)胞間質(zhì)結(jié)合在一起，形成組織。動物體四類根本組織：上皮組織結(jié)締組織肌肉組織神經(jīng)組織

問題

解決方法

提高分辨率

顯微鏡保持組織的原始構(gòu)造化學(xué)固定透光切片、涂片、鋪片、磨片增加反差

染色

區(qū)別不同生化成分組織化學(xué)、放射自顯影、原位雜交觀察生活狀態(tài)

培養(yǎng)組織學(xué)技術(shù)簡介1.光鏡技術(shù)〔lightmicroscope〕2.組織化學(xué)術(shù)〔histochemistry〕3.電鏡技術(shù)〔electronmicroscopy〕4.放射自顯影術(shù)〔autoradiography〕5.細(xì)胞培養(yǎng)術(shù)〔cellculture〕6.組織工程〔tissueengineering〕7.圖像分析術(shù)〔imageanalysis〕一般光鏡技術(shù)中常用三種制片方法１．涂片法液體材料，如血液、精液、各種分泌物、液體培養(yǎng)物等２．鋪片法易撕成薄片的材料，如疏松結(jié)締組織３．切片法將材料經(jīng)處理后切成薄片1.光鏡技術(shù)①取材和固定②脫水和包埋③切片和染色④封片普通組織切片制作過程組織結(jié)構(gòu)的立體形態(tài)與斷面形態(tài)材料塊適宜大小〔0.5cm3〕應(yīng)用各種方法使組織標(biāo)本盡量保持其離體前狀態(tài)的過程稱為固定。固定的目的和機(jī)制：①使蛋白質(zhì)凝固，終止或減少分解酶的作用，防止自溶，保存組織、細(xì)胞的離體前結(jié)構(gòu)狀態(tài)，包括保存組織或細(xì)胞的抗原性，使抗原不失活，不發(fā)生彌散。②保存組織、細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖原、某些維生素及病理性蓄積物，維持病變的特異性特征。③使上述物質(zhì)轉(zhuǎn)為不溶解狀態(tài)，防止和盡量減少制片過程中人為的溶解和喪失。④起助染作用。固定〔fixation〕１．物理學(xué)方法如低溫冷凍，干冰〔dryice，即固態(tài)無水碳酸〕冰凍真空脫水，石蠟滲入法。２．化學(xué)方法采用各種化學(xué)溶液作固定液，使組織細(xì)胞進(jìn)入固定狀態(tài)。固定方法固定時(shí)間小標(biāo)本〔如胃粘膜等〕2～4h，大標(biāo)本應(yīng)置放12～24h。常用固定液１．10％甲醛．２．中性甲醛液甲醛〔濃〕：120ml，水：880ml，NaH2PO4·H2O：4g，Na2HPO4：13g。３．AF液95％乙醇：90ml，甲醛(濃)：10ml。脫水：普通固定液大多是水溶液，必須先脫去組織內(nèi)的水分，為浸蠟創(chuàng)造條件。脫水劑通常使用酒精。脫水的步驟是逐步升高酒精溶液的濃度，以去凈組織塊內(nèi)的水分，最后完全由純酒精取代。10％甲醛液固定后的組織塊，脫水時(shí)應(yīng)依次經(jīng)過70％、80％、90％、95％酒精和無水酒精。透明：因石蠟不溶于酒精而溶于二甲苯，因而組織塊經(jīng)脫水后須再用二甲苯置換出酒精。組織塊浸入二甲苯后逐漸變得透明，故此步驟稱為透明。透明時(shí)間根據(jù)組織塊的大小及性質(zhì)而定。浸蠟：溫箱〔58～60℃〕內(nèi)熔化的石蠟，將透明好的組織塊置入，放置適當(dāng)時(shí)間，使石蠟浸入組織并替換出二甲苯。包埋：在包埋器的內(nèi)壁涂一層甘油，傾入熔化的石蠟，將浸透蠟的組織塊放入包埋器，擺好間距和方位，俟蠟液外表凝固后，將包埋器投入冷水浴中，使石蠟冷卻凝固。包埋后的組織蠟塊，經(jīng)過修整即可用于切片。普通輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)冰凍切片機(jī)切片：在切片機(jī)上將包有組織的蠟塊切成5-6微米的薄片。取下一段蠟帶，置于涂布一層蛋白甘油的載玻片上，滴上適量水，于酒精燈上徐徐加溫，至蠟片在水面展平，別離每張蠟片，傾去水，擺好蠟片位置，放入烤片箱。俟蠟片枯燥并牢固地附著于載玻片后，即可取出，進(jìn)行染色。染色染色的目的是使組織內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)染上不同顏色以便于在顯微鏡下觀察。染色步驟〔蘇木精-伊紅染色法為例〕：注：脫蠟后，假設(shè)組織是用含汞的固定液〔如Susa液、Helly液〕固定，切片還須經(jīng)含碘的70％酒精脫汞后再入70％酒精及蒸餾水。普通染色法即蘇木精-伊紅染色法〔hematoxylin-eosinstaining，HE染色法〕：蘇木精為堿性染料，使染色質(zhì)和核糖體著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，使胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)著紅色嗜酸性〔acidophilia)；嗜堿性(basophilia)HE染色，垂體遠(yuǎn)側(cè)部鍍銀染色：硝酸銀→神經(jīng)細(xì)胞(黑)鍍銀染色，示小腦皮質(zhì)神經(jīng)元醛復(fù)紅與偶氮焰紅染色，示肥大細(xì)胞和彈性纖維醛復(fù)紅與偶氮焰紅染色染色步驟〔HE染色法為例〕：注：脫蠟后，假設(shè)組織是用含汞的固定液〔如Susa液、Helly液〕固定，切片還須經(jīng)含碘的70％酒精脫汞后復(fù)水。封固從二甲苯中取出切片，在切片的組織上滴加適量樹膠，上面再加一蓋玻片，使樹膠布滿于蓋玻片與載玻片之間的間隙，封固即告完成。將封好的切片標(biāo)本放入烤箱，待蓋玻片粘著牢固后，即獲得可供長期觀察和保存的染色標(biāo)本。

應(yīng)用化學(xué)、物理、生物化學(xué)、免疫學(xué)或分子生物學(xué)的原理和技術(shù)，與組織學(xué)技術(shù)結(jié)合而產(chǎn)生，在組織切片顯示某種物質(zhì)的存在和分布狀態(tài)。分類：一般組織化學(xué)術(shù)免疫組織化學(xué)術(shù)原位雜交術(shù)２.組織化學(xué)術(shù)〔histochemistry〕一般組織化學(xué)術(shù)根本原理是在切片上加某種試劑，和組織中的待檢物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反響，其最終產(chǎn)物或?yàn)橛猩恋砦?，以用光鏡觀察，或?yàn)橹亟饘俪恋恚杂秒婄R觀察。一般組織化學(xué)術(shù)糖過碘酸多醛席夫試劑PAS反應(yīng)小腸上皮杯狀細(xì)胞的粘原顆粒紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物例１糖類：PAS〔過碘酸希夫〕反響，顯示多糖和糖蛋白，呈紫紅色例２酶類：酶與特異性底物的反響產(chǎn)物、再與捕捉劑反響，形成有色的沉淀物聯(lián)苯胺法：粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中的過氧化物酶作用于過氧化氫，釋放新生態(tài)氧，使無色的聯(lián)苯胺形成藍(lán)色沉淀。

過氧化物酶染色

例３蘇丹黑B(sudanblackB,SB)是一種能溶解于脂肪中的色素染料，可使細(xì)胞內(nèi)的中性脂肪、磷脂和類固醇著色，即使細(xì)胞內(nèi)微細(xì)結(jié)構(gòu)的脂類物質(zhì)也能顯示出來。

蘇丹黑B染色

組織細(xì)胞中脂滴呈橘紅色，核呈藍(lán)色

例4油紅O染脂類例5甲基綠－派假設(shè)寧反響同時(shí)顯示DNA與RNA免疫組織化學(xué)〔immunohistochemistry〕根據(jù)抗原、抗體特異性結(jié)合原理，用標(biāo)記的抗體與組織中的抗原結(jié)合，標(biāo)記物可于顯微鏡下觀察，檢測組織切片中的肽和蛋白質(zhì)。標(biāo)記物有：熒光素〔熒光顯微鏡觀察〕辣根過氧化物酶〔光鏡或電鏡觀察〕膠體金〔多用于電鏡觀察〕免疫組織化學(xué)原理模式圖熒光素標(biāo)記

毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞呈陽性辣根過氧化物酶標(biāo)記胰島B細(xì)胞呈胰島素陽性膠體金標(biāo)記金顆粒沉積在胰淀粉酶原顆粒部位原位雜交術(shù)〔insituhybridization〕即核酸分子雜交組織化學(xué)術(shù)，檢測基因〔DNA片段〕的有無、基因的表達(dá)活性〔mRNA〕原位雜交臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞呈心房鈉尿肽陽性原理：用帶標(biāo)記物的堿基順序的核酸探針與細(xì)胞內(nèi)待測核酸按堿基配對原那么進(jìn)行特異性原位結(jié)合〔雜交〕，并通過對標(biāo)記物的顯示而獲知待測核酸的有無及相對量。常用標(biāo)記物有放射性核素和地高辛用于觀察組織細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)戊二醛、鋨酸雙重固定→樹脂包埋→超薄切片〔50-80nm厚〕→電子染色〔醋酸鈾、檸檬酸鉛〕根據(jù)電子束在不同結(jié)構(gòu)上被散射程度的差異表現(xiàn)為電子密度高〔黑或深灰色〕和電子密度低〔淺灰色〕透射電鏡圖，漿細(xì)胞透射電鏡術(shù)〔transmissionelectronmicroscopy,TEM〕3.電鏡技術(shù)用于觀察組織細(xì)胞外表構(gòu)造，具有真實(shí)的立體感，無需制備切片掃描電鏡圖，血細(xì)胞掃描電鏡術(shù)〔scanningelectronmicroscopy,SEM〕概念：通過活細(xì)胞對某種放射性物質(zhì)的特異性攝入，以顯示該物質(zhì)在組織和細(xì)胞內(nèi)的分布、含量和代謝過程，借以反映細(xì)胞的功能狀態(tài)例用3H標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷研究DNA合成和細(xì)胞增殖狀態(tài)4.放射自顯影術(shù)〔autoradiography〕5.細(xì)胞培養(yǎng)術(shù)〔cellculture〕把從機(jī)體取得的細(xì)胞在體外模擬體內(nèi)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)組織塊或器官那么稱組織培養(yǎng)術(shù)或器官培養(yǎng)術(shù)用于研究細(xì)胞、組織的代謝、增殖、分化、形態(tài)和功能變化，各種理化因子對活細(xì)胞的影響用相差顯微鏡觀察體外培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞體外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞〔免疫組織化學(xué)染色顯示肌動蛋白〕6.組織工程〔tissueengineering〕用細(xì)胞培養(yǎng)術(shù)在“體〞外模擬構(gòu)建機(jī)體組織或器官的技術(shù)。研究包括四個方面：①種子細(xì)胞，即增殖旺盛的細(xì)胞，多為干細(xì)胞②細(xì)胞外基質(zhì)，可用生物材料〔如牛膠原〕和人工合成高分子材料③構(gòu)建組織或器官，即把細(xì)胞置于細(xì)胞外基質(zhì)中進(jìn)行三維培養(yǎng)、并形成所需要的形狀④將構(gòu)建物移植機(jī)體的方法正在構(gòu)建的有皮膚、軟骨、骨、肌腱、骨骼肌、血管、角膜等；其中以組織工程皮膚較為成功，已成為商品用于治療燒傷、皮膚靜脈性潰瘍等疾病實(shí)驗(yàn)中的組織工程耳7.圖像分析術(shù)〔imageanalysis〕圖像分析術(shù)又稱形態(tài)計(jì)量術(shù)〔morphometry〕，是應(yīng)用數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)原理對組織切片提供的平面圖像進(jìn)行分析，從而獲得立體的組織和細(xì)胞內(nèi)各種有形成分的數(shù)量、體積、外表積等參數(shù),從量的角度顯示結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。目前廣泛應(yīng)用的圖像分析儀可快