基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義

近年來的研究表明，肺癌的轉(zhuǎn)移是一個極其復(fù)雜的多基因控制過程。首先，腫瘤細(xì)胞必須打破細(xì)胞基質(zhì)（tcm）和毛細(xì)血管基底膜，并攻擊周圍組織，以進(jìn)入血液循環(huán)和淋巴管系統(tǒng)。然后在循環(huán)系統(tǒng)中移動，逃離身體的免疫監(jiān)控系統(tǒng)，通過毛細(xì)血管進(jìn)入遠(yuǎn)端組織或器官，在遠(yuǎn)端組織或器官中放置地板，腫瘤血管生成并在遠(yuǎn)端形成傳播池。其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)是參與這一過程中最重要的蛋白酶。已有文獻(xiàn)報道惡性腫瘤中MMPs或TIMPs的表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、分期、分型、生存率的關(guān)系。本研究采用免疫組化方法檢測了108例肺癌標(biāo)本及19例肺良性病變標(biāo)本中MMP-2、MMP-9的表達(dá)情況,旨在探討其與肺癌病理生理特征及預(yù)后的關(guān)系。1材料和方法1.1手術(shù)治療肺癌患者年齡分布情況本實驗的研究對象是非小細(xì)胞肺癌的手術(shù)標(biāo)本,來自四川大學(xué)華西醫(yī)院胸外科1991年1月至1995年4月接受根治性手術(shù)治療的部分肺癌患者108例,年齡31至75歲,平均54.75±9.63歲。另取同期手術(shù)的肺良性病變組織19例作對照,其中男性9例,女性10例;年齡10至60歲,平均39.26±11.99歲;支氣管擴(kuò)張10例,肺結(jié)核瘤2例,炎性假瘤4例,肺膿腫3例。所有肺癌和良性病變標(biāo)本均以10%甲醛固定,石蠟包埋,經(jīng)HE染色病理確診。表1。1.2隆抗體bock1.2.1MMP-2、MMP-9兔抗人多克隆抗體購自武漢博士德(BOSTER)公司。1.2.2生物素化羊抗兔抗體(二抗),以及過氧化物酶-鏈親和素復(fù)合物購自北京中山公司。1.3過氧化酶抗體mmp采用酶-鏈親程素標(biāo)記法(labelledsteptavidin-biotinmethod,LSAB法)。將5μm厚的石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。先經(jīng)3%過氧化氫(H2O2)阻斷內(nèi)源性過氧化酶20分種,微波爐中火15min行抗原修復(fù);然后依次加入正常羊血清(1∶20),一抗(MMP-21∶100,MMP-91∶50),二抗(1∶200);三抗(1∶200),分別于37℃恒溫箱孵育20、60、30、30min,PBS沖洗(除羊血清)。最后DAB-H2O2顯色,蘇木素復(fù)染,加拿大膠封片備查。1.4腫瘤細(xì)漿檢查MMP-2、MMP-9在支氣管黏膜上皮或腫瘤細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)。支氣管黏膜上皮或腫瘤細(xì)漿顯示棕黃色為陽性。每張切片在400倍鏡下觀察5～10個視野,每個視野計數(shù)100～200個支氣管黏膜上皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞,共計1000個細(xì)胞,計算出每張切片的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)作為評價各觀察指標(biāo)在該切片上的表達(dá)水平。1.5統(tǒng)計學(xué)方法本實驗所得數(shù)據(jù)為計量資料,用SPSS10.0統(tǒng)計軟件處理。采取P<0.05為有顯著差異,P<0.01為有非常顯著差異。本研究中采用的統(tǒng)計學(xué)方法有:(1)t檢驗;(2)方差分析;(3)對數(shù)秩和檢驗;(4)Kaplan-meier生存曲線;(5)Cox比例風(fēng)險模型;(6)直線相關(guān)回歸分析;(7)χ2檢驗。2結(jié)果2.1mmp-2和mmp-9對肺良惡性細(xì)胞的定位MMP-2、MMP-9均主要定位于細(xì)胞漿內(nèi),少數(shù)定位于細(xì)胞核上。2.2各組小鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分期的比較2.2.1從表2可見癌旁肺組織、肺良性病變組織MMP-2、MMP-9表達(dá)水平均顯著低于肺癌組織(P<0.05)。2.2.2MMP-2、MMP-9在鱗癌、腺癌、腺鱗癌中的表達(dá)水平分別為67.5%、56.0%、53.8%和55.2%、44.9%、44.7%,二者在三組間的表達(dá)水平均有顯著差異(P<0.05),兩兩比較,MMP-2、TIMP-2在鱗癌中的表達(dá)水平顯著高于腺癌和腺鱗癌,后二者的表達(dá)水平無顯著差異。MMP-2、MMP-9表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分期的關(guān)系有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC的MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平隨病理分期增高而增高,Ⅲ+Ⅳ期肺癌的表達(dá)水平均顯著高于Ⅰ+Ⅱ期肺癌(P<0.05)。MMP-2、MMP-9表達(dá)水平與腫瘤分化程度無明顯關(guān)系(P>0.05)。2.3直線相關(guān)分析結(jié)果為了探討肺癌組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平之間的相關(guān)性,本研究采用直線相關(guān)(Pearson-correlation)分析比較了兩者之間的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)兩者之間呈非常顯著正相關(guān)關(guān)系,r=0.474(P<0.01)。2.4mmp-2、mmp-9表達(dá)水平與術(shù)后生存率的關(guān)系本研究根據(jù)MMP-2、MMP-9表達(dá)水平將研究對象分為高表達(dá)組(MMP-2表達(dá)水平>59.5%,MMP-9表達(dá)水平>68%)和低表達(dá)組(MMP-2表達(dá)水平≤59.5%,MMP-9表達(dá)水平≤68%),用KAPLAN-MEIER曲線和對數(shù)秩和檢驗分別分析MMP-2、MMP-9表達(dá)水平與術(shù)后生存率的關(guān)系發(fā)現(xiàn):2.4.1MMP-2高表達(dá)組(Group2)肺癌患者5年生存率為0,低表達(dá)組(Group1)5年生存率為51.26%,兩組間比較有非常顯著性差異(P<0.01)(圖1)。2.4.2MMP-9高表達(dá)組(Group2)肺癌患者5年生存率為2.52%,低表達(dá)組(Group1)5年生存率為49.98%,兩組間比較有非常顯著性差異(P<0.01)(圖2)。2.5腫瘤細(xì)胞分化本研究采用COX比例風(fēng)險模型分析可能影響肺癌預(yù)后的各項因素,包括(1)性別(Gender),(2)年齡(Age),(3)肺癌的組織學(xué)類型(Path),(4)腫瘤細(xì)胞分化程度(Diff),(5)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)(Ln),(6)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移狀態(tài)(Dm),(7)病理分期(Stages),(8)支氣管斷端殘留情況(Rc),(9)吸煙(Smoke),(10)原發(fā)腫瘤部位(location),(11)MMP-2表達(dá)水平,(12)MMP-9表達(dá)水平。結(jié)果如表3所示,其中MMP-2、MMP-9表達(dá)對于預(yù)測肺癌預(yù)后具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。3p-2和mmp-9在肺癌患者治療中的表達(dá)水平惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個極其復(fù)雜的多步驟多階段發(fā)展過程,包括侵襲、循環(huán)擴(kuò)散、遠(yuǎn)處克隆和血管生成。細(xì)胞外基質(zhì)的降解是其中的關(guān)鍵步驟之一,只有完成了對細(xì)胞外基質(zhì)的降解才使腫瘤細(xì)胞突破ECM構(gòu)成的結(jié)構(gòu)屏障,向周圍組織侵襲或進(jìn)入血循環(huán)或淋巴系統(tǒng),然后在循環(huán)系統(tǒng)中遷移,逃避機(jī)體免疫監(jiān)視系統(tǒng),突破毛細(xì)血管基底膜,進(jìn)入遠(yuǎn)處組織或器官內(nèi),在遠(yuǎn)處組織或器官內(nèi)著床,腫瘤血管生成,最后在遠(yuǎn)處形成轉(zhuǎn)移灶。MMPs能降解ECM的絕大多數(shù)成分,因而MMPs在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。已有文獻(xiàn)報道在食道癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌、腦腫癌、前列腺癌、結(jié)腸癌中都有MMPs的過度表達(dá)。MMP-2、MMP-9均屬明膠酶類,是能夠降解IV型膠原的主要基質(zhì)水解酶。研究MMP-2和MMP-9在肺癌中的表達(dá)對闡明肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制,提供逆轉(zhuǎn)其轉(zhuǎn)移的思路有重要理論和臨床意義。本研究觀察到:(1)肺癌組織中MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著高于癌旁肺組織和良性病變肺組織(P<0.05);這與Thomas等人觀察到的現(xiàn)象一致。(2)MMP-2、MMP-9在肺癌組織的表達(dá)水平與肺癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系,提示MMP-2、MMP-9可以影響腫瘤侵潤的范圍,這與MMPs能降解ECM的絕大多數(shù)成分的功能是一致的。(3)在本研究中MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平與肺癌分化程度無明顯關(guān)系。(4)MMP-2、MMP-9在腺癌及腺鱗癌中的表達(dá)水平均顯著低于在鱗癌中的表達(dá)水平。這與臨床上觀察到的腺癌轉(zhuǎn)移性較鱗癌高的現(xiàn)象不一致,可能是由于①腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移還同時受到其他多種因素的調(diào)節(jié),如與VEGF,P53,nm23,E-Cadherin等有關(guān);②MMPs更主要的是在腫瘤轉(zhuǎn)移早期,侵襲的過程中起作用,腺癌易于發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移可能與血管生成等因素聯(lián)系更緊密,而鱗癌的局部侵襲能力要強(qiáng)于腺癌。MMPs表達(dá)相關(guān)相關(guān)性的了解有助于了解二者之間相互作用關(guān)系與調(diào)節(jié)關(guān)系。已進(jìn)行的關(guān)于MMPs表達(dá)水平之間相關(guān)性的研究還比較缺乏,結(jié)果也不盡一致。本研究觀察到肺癌中MMP-2、MMP-9表達(dá)水平之間呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。這可能是由于MMPs的活化過程中,MMPs的相互作用廣泛存在,尤其是MT1-MMP,MMP-2對其他MMPs的表達(dá)相互關(guān)聯(lián)。研究肺癌預(yù)后,可以客觀的評價臨床治療效果,權(quán)衡治療方法恰當(dāng)與否。因此,探索肺癌肺癌預(yù)后指標(biāo)對于完善多學(xué)科綜合治療方案,提高療效具有重要意義。已有多項研究表明,MMPs的表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān),并與腫瘤的預(yù)后聯(lián)系緊密。本研究觀察到:(1)MMP-2,MMP-9高表達(dá)組的5年生存率均顯著