第二章微生物發(fā)酵制藥技術(shù)1整理課件發(fā)酵發(fā)酵制藥發(fā)酵制藥的根本過程第一節(jié)概述2整理課件概念：通過微生物培養(yǎng)而獲得產(chǎn)物的過程種類：用產(chǎn)品說明，如青霉素發(fā)酵、維生素發(fā)酵初級代謝產(chǎn)物：在初級代謝過程中形成產(chǎn)物，包括各種小分子前體、單體和多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、核酸等，是生長所必須的，幾乎所有生物初級代謝根本相同。氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸。次級代謝產(chǎn)物：是比較復(fù)雜的化合物，不是細(xì)胞生長必需的，對生命有意義〔抗逆境條件〕?？股?、毒素、色素。發(fā)酵3整理課件發(fā)酵罐發(fā)酵4整理課件立式臥式搖床發(fā)酵5整理課件靜置發(fā)酵6整理課件利用制藥微生物的生長繁殖，通過發(fā)酵、代謝合成藥物，然后從中提取、精制純化，獲得藥品的過程。發(fā)酵制藥7整理課件發(fā)酵制藥流程8整理課件發(fā)酵制藥工藝9整理課件菌體生長與產(chǎn)物合成的三個階段：發(fā)酵前期〔fermentationprophase)菌體生長期〔cellgrowthphase)發(fā)酵中期(fermentationmetphase)產(chǎn)物合成期〔productsynthesisphase)發(fā)酵后期〔fermentationanahase〕菌體自溶期〔cellautolysisphase)微生物發(fā)酵根本過程特征10整理課件從接種至菌體到達(dá)一定臨界濃度的時間，包括延滯期、對數(shù)生長期和減速期。代謝特征：碳源、氮源等基質(zhì)不斷消耗生長特征：菌體不斷地生長和繁殖，生物量增加。溶氧變化：不斷下降，菌體臨界值時，濃度最低。pH變化：先升后降－以氨基酸為碳源，釋放氨，后氨被利用。先降后升－以糖為碳源，釋放出丙酮酸等有機(jī)酸，后被利用。發(fā)酵前期特征11整理課件以次級代謝產(chǎn)物或目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成為主的一段時間。菌體生長恒定就進(jìn)入產(chǎn)物合成階段。呼吸強(qiáng)度：無明顯變化，菌體數(shù)目不增加。產(chǎn)物量：逐漸增加，生產(chǎn)速率加快，至最頂峰后合成能力衰退。對外界變化敏感:容易影響代謝過程，從而影響整個發(fā)酵過程。發(fā)酵中期特征12整理課件菌體衰老，細(xì)胞開始自溶的一段時間合成產(chǎn)物能力衰退，生產(chǎn)速率減慢氨基氮含量增加，pH上升發(fā)酵必須結(jié)束，否那么產(chǎn)物被破壞，菌體自溶給過濾和提取帶來困難發(fā)酵后期特征13整理課件第二節(jié)制藥微生物與產(chǎn)物的生物合成制藥微生物的選擇制藥微生物的選育微生物菌種的保藏微生物代謝產(chǎn)物的生物合成微生物生物合成的調(diào)節(jié)14整理課件〔1〕所需培養(yǎng)基易得，價格低廉；〔2〕培養(yǎng)和發(fā)酵條件溫和〔糖濃度、溫度、pH、溶解氧、滲透壓等〕〔3〕生長速度和反響速度較快，發(fā)酵周期短〔4〕單產(chǎn)高〔選擇野生型、營養(yǎng)缺陷型或調(diào)節(jié)突變株〕〔5〕抗病毒能力強(qiáng)〔6〕菌種純粹，不易變異退化，穩(wěn)定性好〔7〕菌體不是病源菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素〔包括抗生素、激素和毒素〕，保證平安一、制藥微生物的選擇15整理課件來源：大陸土壤、海洋水體樣品的采集：表層土壤(0-10cm)，海洋〔0-100m〕預(yù)處理：根據(jù)別離目的和微生物的特性1〕溫度2〕水分去除，3〕化學(xué)：SDS－酵母膏，CaCO3，NaOH處理，減少細(xì)菌，有利于放線菌別離；乙酸乙酯、氯仿、苯處理，除去真菌。4〕離心、膜別離。生產(chǎn)菌的自然別離16整理課件培養(yǎng)基：選擇適宜的培養(yǎng)基，營養(yǎng)和pH，添加抑制劑如抗生素，制霉菌素等。別離方法：1〕稀釋法：無菌水，生理鹽水，緩沖溶液2〕濾膜法：0.22－0.45um。細(xì)菌在膜上，放線菌菌絲可穿透，進(jìn)入培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件：放線菌25-30℃，32-37℃，45-50℃，7-14天至1月。17整理課件二、制藥微生物菌種的選育1、選育的目的改善菌種的特性，使產(chǎn)量提高，改進(jìn)質(zhì)量、降低本錢、改革工藝、方便管理及綜合利用等2、選育的方法：A、自然選育；B、誘變育種C、雜交育種18整理課件定義：不經(jīng)過人工誘變處理，根據(jù)菌種的自然突變而進(jìn)行的菌種篩選過程。應(yīng)用：1〕菌種的純化2〕菌株的復(fù)壯。2〕選育高產(chǎn)菌株自然選育19整理課件菌種別離純化1。稀釋涂布2。平板劃線純化20整理課件斜面?zhèn)鞔?1整理課件誘變育種定義：但凡利用誘變劑處理分散而均勻的微生物群體，促進(jìn)其基因發(fā)生突變的育種技術(shù)。方法：1〕物理類：紫外線，快中子，激光，太空射線.2〕化學(xué)類：堿基類似物，嵌合劑，亞硝酸。3〕生物類：噬菌體。特點(diǎn)：快速、簡單、效益大。缺點(diǎn):定向性差。22整理課件出發(fā)菌種的選擇：較高產(chǎn)，對誘變劑敏感誘變劑的使用：交叉使用多種，合理組合。中等劑量〔80％致死率〕選擇壓：施加一定的選擇壓，獲得耐藥菌株。措施：添加抗生素，提高前體濃度，增加產(chǎn)物濃度。誘變方案設(shè)計(jì)23整理課件誘變育種流程24整理課件1、誘變育種中需要考慮的假設(shè)干因素〔1〕選擇適宜的出發(fā)菌株產(chǎn)量高、對誘變劑的敏感性大、變異幅度廣〔2〕復(fù)合誘變劑的使用單一誘變劑重復(fù)使用后突變的效果不好，可用復(fù)合誘變劑來擴(kuò)大誘變幅度，提高誘變效果?！?〕誘變劑量的選擇致死率取決于誘變劑量，而致死率和誘變率之間有一定的關(guān)系。因此可以用致死劑量來作為選擇適宜劑量的依據(jù)。但凡能增加變異的幅度又能促使變異向正變范圍移動的劑量就是適宜劑量。〔4〕變異菌株的篩選25整理課件2、新誘變技術(shù)〔1〕低能離子束誘變：離子注入是20世紀(jì)80年代興起的一種外表處理技術(shù)。這種相互作用過程大致分為能量沉積、動量傳遞、離子注入和電荷交換等四個原初反響過程，在10－19－10－13s中間時發(fā)生。荷能離子注入除具有Y射線能量沉積引起機(jī)體損傷的特征外，還具有動能交換產(chǎn)生的級聯(lián)損傷，表現(xiàn)為遺傳物質(zhì)原子轉(zhuǎn)移、重排或基因的缺失。還有慢化離子、移位原子和本底元素復(fù)合反響造成的化學(xué)損傷以及電荷交換引起的生物分子電子轉(zhuǎn)移造成的損傷。離子注入生物學(xué)效應(yīng)顯示出一些不同于輻射生物學(xué)的特征，相當(dāng)于物理和化學(xué)誘變兩者相結(jié)合的復(fù)合誘變效應(yīng)〔2〕激光輻射誘變和微波電磁輻射誘變26整理課件概念：不同基因型的品系或種屬間，通過交配或體細(xì)胞融合等手段形成雜種，或者是通過轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)形成重組體，從中別離篩選出具有優(yōu)良性狀的新菌株。特點(diǎn)：有一定的定向性。種類：體細(xì)胞重組、接合、原生質(zhì)體融合。雜交育種27整理課件通過生物學(xué)、化學(xué)或物理學(xué)的方法，使兩個不同種類的體細(xì)胞融合在一起，從而產(chǎn)生具有兩個親本遺傳性狀的新細(xì)胞。原生質(zhì)體融合28整理課件體細(xì)胞重組育種29整理課件結(jié)合育種30整理課件定向分子育種概念：在分子水平，體外模擬自然進(jìn)化機(jī)制，是突變、重組、選擇的重復(fù)循環(huán)。目的：獲得有益突變，淘汰有害突變，使進(jìn)化向有益方向開展。定向分子育種31整理課件防止菌株衰退的措施菌種退化：菌種的發(fā)酵能力降低、繁殖能力降低、發(fā)酵產(chǎn)品的得率降低.1、衰退的可能原因〔1〕、基因突變〔2〕、別離現(xiàn)象2、防止菌種衰退的方法

A、從菌種選育方面考慮；B、盡量減少傳代次數(shù)C、創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件；D、利用不易衰退的細(xì)胞傳代;E、采用有效的菌種保藏方法32整理課件3.菌種復(fù)壯方法①純種別離法；②淘汰已衰退的個體③采用其它方法：誘變因素處理，再進(jìn)行單菌落別離；選擇適宜的培養(yǎng)基33整理課件原因：菌種經(jīng)過屢次傳代，會發(fā)生遺傳變異，導(dǎo)致退化，從而喪失生產(chǎn)能力甚至菌株死亡。目的：保持菌種原有優(yōu)良特性，延長生命時限，長期存活、不退化。原理：根據(jù)菌種的生物生理、生化特點(diǎn)，人工地創(chuàng)造條件，使菌種的代謝活動處于不活潑狀態(tài)，生長繁殖處于休眠狀態(tài)。關(guān)鍵：保藏時首先要挑選優(yōu)良純種，最好是它們的休眠體〔孢子、芽孢等〕，其次是要創(chuàng)造一個最有利于休眠的環(huán)境，如低溫、枯燥、缺氧和缺乏營養(yǎng)物質(zhì)等，以到達(dá)降低其代謝活動，延長保存期的目的。三、微生物菌種的保藏34整理課件菌種保藏的方法斜面保藏法、礦物油保藏法、砂土保管保藏法、真空冷凍枯燥法、冷凍法、液態(tài)真空枯燥法、瓊脂穿刺封口保藏法、曲法保藏、麥粒保藏法、無水硅膠保藏法。35整理課件〔1〕斜面保藏法：在4℃左右的冰箱保藏，每隔一定時間進(jìn)行移植培養(yǎng)后再繼續(xù)保藏，如此反復(fù)。優(yōu)點(diǎn)：方法簡單、存活率高，具有一定的保藏效果。缺點(diǎn)：菌種仍有一定的強(qiáng)度的代謝活動條件，保存時間不長〔1－6個月〕，傳代多，菌種容易變異。適用菌種：細(xì)菌、酵母、防線菌、霉菌36整理課件〔2〕礦物油保藏法將生長好的斜面在無菌條件下倒入已滅菌的液體石蠟，油層高于斜面末端1cm，然后放于冰箱中保存。適用菌種：適用于除細(xì)菌外的其它菌種〔3〕砂土管保藏法利用土壤顆粒對微生物起保護(hù)作用，提高微生物的存活率。其包括砂土制備和真空抽干兩步。適用菌種：產(chǎn)孢子的微生物，對于一些對枯燥敏感的細(xì)菌〔奈氏球菌、弧菌、假單胞桿菌〕以及酵母不適用。37整理課件〔4〕真空冷凍枯燥法先在菌懸液參加保護(hù)劑〔如：脫脂牛奶、血清等〕然后在較低溫度下使成凍結(jié)狀態(tài)，最后減壓抽干。特點(diǎn)：它是菌種保藏中最有效的一種方法。保存期可達(dá)一年至數(shù)十年之久，并且存活率高，變異率低。但是手續(xù)麻煩，需要一定的設(shè)備。適用菌種：對于不長孢子或長的很少孢子的真菌保藏效果不佳。38整理課件〔5〕其他保藏方法冷凍法：分低溫冷凍〔－20℃〕與超低溫冷凍〔－196℃〕兩種。適用于細(xì)菌、真菌、病毒等的保藏液態(tài)真空枯燥法：菌體在恒溫液態(tài)條件下進(jìn)行真空枯燥。適用于包括細(xì)菌、病毒，特別適用于冷凍枯燥保藏效果不佳的菌種。瓊脂穿刺封口保藏法：適用于不產(chǎn)孢子細(xì)菌的保藏39整理課件曲法保藏：將麩皮與水按比例混合，滅菌后接入菌種，待孢子長成后即為成曲。將試管放入盛有氯化鈣的枯燥器中，枯燥后低溫保藏。適用于有大量孢子的霉菌和某些放線菌的保藏。麥粒保藏法：麥粒滅菌后接入菌液，培養(yǎng)有菌絲或孢子時，置通風(fēng)、避光、枯燥處保藏。適用于一些放線菌、芽孢桿菌、酵母的保藏。無水硅膠保藏法：將細(xì)胞懸浮液和等體積的脫脂滅菌牛奶混勻，參加裝有無水硅膠的試管中，然后將試管放于枯燥器內(nèi)，室溫或4℃保藏。對于細(xì)菌和真菌效果都較好。40整理課件國內(nèi)外菌種保藏機(jī)構(gòu)菌種是一個國家的重要資源，世界各國對菌種的保藏都極為重視。世界上有700多家菌菌種保藏機(jī)構(gòu)，其中國際知識產(chǎn)權(quán)組織成認(rèn)的法定的保藏機(jī)構(gòu)僅有28家。41整理課件

1、我國的微生物菌種保藏機(jī)構(gòu)1〕普通微生物菌種保藏管理中心〔CCGMC〕中科院微生物所，北京，中科院武漢病毒研究所2〕農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心〔ACCC〕中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，北京〔ISF〕3〕工業(yè)微生物菌種保藏管理中心〔CICC〕中國食品發(fā)酵工業(yè)科學(xué)研究院，北京，〔IFFI〕4〕醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心〔CMCC〕中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所，南京衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所，北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所5〕抗生素菌種保藏管理中心〔CACC〕中國醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)院抗生素研究所，北京四川抗生素工業(yè)研究所，成都華北制藥廠抗生素研究所，石家莊6〕獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心〔CVCC〕農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品檢察所，北京42整理課件2、國外主要的微生物菌種保藏機(jī)構(gòu)1〕美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所〔ATCC〕2〕美國冷泉港研究所〔CSH〕3〕日本東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所〔IAM〕4〕日本東京科研化學(xué)〔KCC〕5〕日本大阪發(fā)酵研究所〔IFO〕6〕英國國立標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所〔NCTC〕7〕美國國立衛(wèi)生研究所〔NIH〕8〕美國農(nóng)業(yè)部北方開發(fā)利用研究部〔NRRL〕43整理課件第三節(jié)發(fā)酵工藝條件確實(shí)定培養(yǎng)基及其制備滅菌操作發(fā)酵工藝條件確實(shí)定及主要控制參數(shù)44整理課件培養(yǎng)基〔medium)：供微生物生長繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物按微生物的主要類群來說，它們所需要的培養(yǎng)基成分也不同。

細(xì)菌：

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、LB

(Luria-Bertani)

放線菌：高氏一號培養(yǎng)基

真菌：

查氏合成培養(yǎng)基、PDA(Potato-Dextrose-Agar)

酵母菌；

麥芽汁培養(yǎng)基的組成和比例是否恰當(dāng)，直接影響微生物的生長、生產(chǎn)和工藝選擇、產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。一培養(yǎng)基45整理課件碳源氮源無機(jī)鹽水生長因子前體與促進(jìn)劑消泡劑培養(yǎng)基的成分46整理課件概念：

構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中碳的營養(yǎng)物質(zhì)。作用：

為正常生理活動和過程提供能量來源，為細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物合成提供碳骨架。碳源47整理課件糖類：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜脂肪：豆油、棉籽油、豬油醇類：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白類：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖類、有機(jī)酸遲效碳源:酪蛋白水解產(chǎn)生的脂肪酸碳源的種類48整理課件概念：

構(gòu)成微生物和代謝產(chǎn)物中氮素的營養(yǎng)物質(zhì)作用:

為生長和代謝提供氮源種類：無機(jī)氮源、有機(jī)氮源氮源49整理課件幾乎所有微生物都能利用有機(jī)氮源黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、蛋白胨、酵母粉、尿素有機(jī)氮源50整理課件氨水、銨鹽和硝酸鹽等。銨鹽比硝酸鹽更快利用。工業(yè)應(yīng)用：主要氮源和輔助氮源；調(diào)節(jié)pH值生理酸性物質(zhì)：代謝后能產(chǎn)生酸性殘留物質(zhì)，如〔NH4)2SO4利用后，產(chǎn)生硫酸生理堿性物質(zhì)：代謝后能產(chǎn)生堿性殘留物質(zhì)。如NaNO3利用后，產(chǎn)生氫氧化鈉。無機(jī)氮源51整理課件概念：組成生理活性物質(zhì)或具有生理調(diào)節(jié)作用的礦物質(zhì)。作用方式：低濃度起促進(jìn)作用，高難度起抑制作用種類：P、S、K、Na、Mg、Ca常常添加Fe、Zn、Cu、Mo、Co、Mn、Cl，一般不加無機(jī)鹽與微量元素52整理課件水菌體細(xì)胞的主要成分營養(yǎng)傳遞的介質(zhì)良好導(dǎo)體，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長環(huán)境溫度培養(yǎng)基的主要成分。53整理課件概念：維持微生物生長所必需的微量有機(jī)物，不起碳源和氮源作用。種類：維生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。天然成分中含有：一般無需添加。營養(yǎng)缺陷型菌株：必需添加。生長因子〔growthfactor〕54整理課件概念：參加到發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些化合物，被直接結(jié)合到目標(biāo)產(chǎn)物分子中，而自身的結(jié)構(gòu)無多大變化。使用：添加前體是提高抗生素產(chǎn)量的重要措施屢次少量添加前體〔precurtsor〕55整理課件概念：促進(jìn)產(chǎn)物生成的物質(zhì)，但不是營養(yǎng)物，也不是前體的一類化合物。種類：氯化物有利于灰黃霉素、金霉素合成。外表活性劑吐溫、清洗劑，脂溶性小分子化合物等，起誘導(dǎo)作用。促進(jìn)劑〔accelerant〕56整理課件概念：降低泡沫的液膜強(qiáng)度和外表粘度，使泡沫破裂的化合物。種類：油脂類、酯類、硅油及聚氧乙烯－聚氧丙烯甘油醚。天然動植物油脂類、高分子化合物〔高碳醇脂肪酸和酯類、聚醚類、硅酮類〕作用：消除泡沫，防止逃液和染菌。消沫劑(defoamingagent)57整理課件按用途：選擇性、鑒別性、富營養(yǎng)培養(yǎng)基等按物理性質(zhì):固體、半固體、液體培養(yǎng)基按化學(xué)組成：合成、半合成、天然培養(yǎng)基按發(fā)酵過程中所處位置和作用：斜面或平板固體、種子、發(fā)酵和補(bǔ)料培養(yǎng)基。培養(yǎng)基種類58整理課件概念：細(xì)菌和酵母的固體斜面或平板培養(yǎng)基，鏈霉素和絲狀真菌的孢子培養(yǎng)基。制備：液體培養(yǎng)基添加1.0-2.0％瓊脂粉。作用：提供菌體的生長繁殖，形成孢子固體培養(yǎng)基59整理課件單細(xì)胞培養(yǎng)基：營養(yǎng)豐富，滿足菌體生長迅速，不能引起變異。孢子培養(yǎng)基：基質(zhì)濃度較低，無機(jī)鹽濃度適量，以利于孢子形成。營養(yǎng)不宜太豐富，否那么不易產(chǎn)生孢子。固體培養(yǎng)基－要求60整理課件概念：供孢子發(fā)芽和菌體生長繁殖，搖瓶和種子罐培養(yǎng)基，液體。作用：使種子擴(kuò)大培養(yǎng)，增加細(xì)胞數(shù)目，生長形成強(qiáng)壯、健康和高活性的種子種子培養(yǎng)基〔seedmedium〕61整理課件培養(yǎng)基成分必需完全，營養(yǎng)豐富。用速效性、容易利用的碳、氮源和無機(jī)鹽等物質(zhì)，但濃度不宜高。種子培養(yǎng)基要與發(fā)酵培養(yǎng)基相適應(yīng)，主要成分接近，不能差異太大。縮短發(fā)酵的延滯期。種子培養(yǎng)基－要求62整理課件概念：提供微生物生長、目標(biāo)產(chǎn)物生成的生產(chǎn)用培養(yǎng)基作用：不僅要滿足菌體的生長和繁殖，還要滿足菌體合成目標(biāo)產(chǎn)物，是發(fā)酵生產(chǎn)中最關(guān)鍵和最重要的培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基的要求：

營養(yǎng)物質(zhì)濃度和粘度適中，組成上豐富完整。不同菌種和不同產(chǎn)物，對培養(yǎng)基的要求差異很大，組成和配方需要優(yōu)化。發(fā)酵培養(yǎng)基〔fermentationmedium)63整理課件概念：發(fā)酵過程中添加補(bǔ)充的培養(yǎng)基。作用：穩(wěn)定工藝條件，延長發(fā)酵周期，提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。組成：各種必要的營養(yǎng)物質(zhì)，碳源、氮源、前體制備：按單一成分配制，各自獨(dú)立控制，或按一定比例制成復(fù)合補(bǔ)料培養(yǎng)基補(bǔ)料培養(yǎng)基64整理課件控制發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量65整理課件66整理課件67整理課件68整理課件培養(yǎng)基設(shè)計(jì)一般原那么69整理課件二、滅菌操作工藝70整理課件由于各種發(fā)酵過程所用的微生物菌種、培養(yǎng)基以及發(fā)酵的條件、產(chǎn)物的性質(zhì)不同，染菌造成的危害程度也不同。不管是對于哪種發(fā)酵過程，一旦發(fā)生染菌，都會由于培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分被消耗或代謝產(chǎn)物被分解，嚴(yán)重影響到產(chǎn)物的生成，使發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量大為降低。一〕、染菌對不同發(fā)酵過程的影響71整理課件1〕青霉素發(fā)酵過程：由于許多雜菌都能產(chǎn)生青霉素酶，因此不管染菌是發(fā)生在發(fā)酵前期、中期或后期，都會使青霉素迅速分解破壞，使目的產(chǎn)物得率降低，危害十分嚴(yán)重。2〕核苷或核苷酸發(fā)酵過程：由于所用的生產(chǎn)菌種是多種營養(yǎng)缺陷型微生物，其生長能力差，所需的培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，因此容易受到雜菌的污染，且染菌后，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分迅速被消耗，嚴(yán)重抑制了生產(chǎn)菌的生長和代謝產(chǎn)物的生成。72整理課件3〕檸檬酸等有機(jī)酸發(fā)酵過程：一般在產(chǎn)酸后發(fā)酵液的pH值比較低，雜菌生長十分困難，在發(fā)酵中、后期不太會發(fā)生染菌，主要是要預(yù)防發(fā)酵前期染菌。4〕谷氨酸發(fā)酵：周期短，生產(chǎn)菌繁殖快，培養(yǎng)基不太豐富，一般較少污染雜菌，但噬菌體污染對谷氨酸發(fā)酵的影響較大。73整理課件種子培養(yǎng)期染菌染菌發(fā)生的不同時間對發(fā)酵的影響種子培養(yǎng)主要是使微生物細(xì)胞生長與繁殖，此時，微生物菌體濃度低，培養(yǎng)基營養(yǎng)十分豐富，比較容易染菌。假設(shè)將污染的種子帶入發(fā)酵罐，那么危害極大，因此應(yīng)嚴(yán)格控制種子染菌的發(fā)生。一旦發(fā)現(xiàn)種子受到雜菌的污染，應(yīng)經(jīng)滅菌后棄去，并對種子罐、管道等進(jìn)行仔細(xì)檢查和徹底滅菌。由于接種量較小，生產(chǎn)菌生長一開始不占優(yōu)勢，而且培養(yǎng)液中幾乎沒有抗生素〔產(chǎn)物〕或只有很少抗生素〔產(chǎn)物〕。因而它防御雜菌能力低，容易污染雜菌。74整理課件發(fā)酵前期染菌在發(fā)酵前期，微生物菌體主要是處于生長、繁殖階段，此時期代謝的產(chǎn)物很少，相對而言這個時期也容易染菌。染菌后的雜菌將迅速繁殖，與生產(chǎn)菌爭奪培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌的正常生長、繁殖及產(chǎn)物的生成。原因：發(fā)酵前期菌量不很多，與雜菌沒有競爭優(yōu)勢；且還未合成產(chǎn)物〔抗生素〕或產(chǎn)生很少，抵御雜菌能力弱。在這個時期要特別警惕以制止染菌的發(fā)生。染菌補(bǔ)救措施：可以用降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整補(bǔ)料量，用酸堿調(diào)pH值，縮短培養(yǎng)周期等措施予以補(bǔ)救。如果前期染菌，且培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，可以重新滅菌，補(bǔ)加一些營養(yǎng)，重新接種再用。75整理課件發(fā)酵中期染菌發(fā)酵中期染菌將會導(dǎo)致培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，并嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌的代謝，影響產(chǎn)物的生成。有的染菌后雜菌大量繁殖，產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使pH值下降，糖、氮等的消耗加速；菌體自溶，致使發(fā)酵液發(fā)粘，產(chǎn)生大量的泡沫，有時也會使發(fā)酵液發(fā)臭，代謝產(chǎn)物的積累減少或停止；有的染菌后會使已生成的產(chǎn)物被利用或破壞。措施降溫培養(yǎng)，減少補(bǔ)料，密切注意代謝變化情況。如果發(fā)酵單位到達(dá)一定水平可以提前放罐，或者抗生素生產(chǎn)中可以將高單位的發(fā)酵液輸送一局部到染菌罐，抑制雜菌。76整理課件發(fā)酵后期染菌由于發(fā)酵后期培養(yǎng)基中的糖等營養(yǎng)物質(zhì)已接近耗盡，且發(fā)酵的產(chǎn)物也已積累較多，如果染菌量不太多，對發(fā)酵影響相對來說就要小一些，可繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵。對發(fā)酵產(chǎn)物來說，發(fā)酵后期染菌對不同的產(chǎn)物的影響也是不同的，如抗生素、檸檬酸的發(fā)酵，染菌對產(chǎn)物的影響不大；肌苷酸、谷氨酸等地發(fā)酵，后期染菌也會影響產(chǎn)物的產(chǎn)量、提取和產(chǎn)品的質(zhì)量。發(fā)酵后期發(fā)酵液內(nèi)已積累大量的產(chǎn)物，特別是抗生素，對雜菌有一定的抑制或殺滅能力。因此如果染菌不多，對生產(chǎn)影響不大。如果染菌嚴(yán)重，又破壞性較大，可以提前放罐。77整理課件發(fā)酵過程污染雜菌是發(fā)酵工業(yè)的致命傷。造成大量原材料的浪費(fèi)，在經(jīng)濟(jì)上造成巨大損失擾亂生產(chǎn)秩序，破壞生產(chǎn)方案。遇到連續(xù)染菌，特別在找不到染菌原因往往會影響人們的情緒和生產(chǎn)積極性。影響產(chǎn)品外觀及內(nèi)在質(zhì)量78整理課件顯微鏡檢查法二〕、染菌的檢查和判斷

用革蘭氏染色法對樣品進(jìn)行涂片染色，顯微鏡下觀察微生物的形態(tài)特征，根據(jù)生產(chǎn)菌和雜菌的特征進(jìn)行區(qū)別、判斷是否染色。如發(fā)現(xiàn)了與生產(chǎn)菌形態(tài)特征不一樣的其他微生物存在，就可判斷為發(fā)生了染菌。此法檢查雜菌最為簡單、直接，也是常用的方法之一。必要時還可進(jìn)行芽孢染色或鞭毛染色。79整理課件肉湯培養(yǎng)法

通常用葡萄糖酚紅肉湯作為培養(yǎng)基，將待檢樣品直接接入經(jīng)完全滅菌后的肉湯培養(yǎng)基中，分別于37°C進(jìn)行培養(yǎng)，隨時觀察微生物的生長情況，并取樣進(jìn)行鏡檢，判斷是否染菌。肉湯培養(yǎng)法常用于檢查培養(yǎng)基和無菌空氣是否帶菌，同時此法也用于噬菌體的檢查。80整理課件平板培養(yǎng)

將待檢樣品在無菌平板上劃線，分別于37°C、27°C進(jìn)行培養(yǎng)，一般24h后即可進(jìn)行鏡檢觀察，檢查是否染菌。有時為了提高平板培養(yǎng)法的靈敏度，也可以將需要檢查的樣品先置于37°C條件下培養(yǎng)6h，使雜菌迅速增值后再劃線培養(yǎng)。無菌實(shí)驗(yàn)時，如果肉湯連續(xù)三次發(fā)生變色反響〔由紅色變?yōu)辄S色〕或產(chǎn)生渾濁，或平板培養(yǎng)連續(xù)三次發(fā)現(xiàn)有異常菌落的出現(xiàn)，即可判斷為染菌。81整理課件抗生素發(fā)酵染菌原因分析〔日本工業(yè)技術(shù)院發(fā)酵研究所〕工程百分率%種子帶菌或疑心種子帶菌9.64接種時罐壓跌零0.19培養(yǎng)基滅菌不透0.79總空氣系統(tǒng)有菌19.96泡沫冒頂0.48夾套穿孔12.36盤管穿孔5.89接種管穿孔0.39閥門滲漏1.45攪拌軸密封滲漏2.09罐蓋漏1.54其它設(shè)備滲漏10.13操作原因10.15原因不明24.9482整理課件三〕、噬菌體污染及其防治發(fā)酵過程中如果受噬菌體的侵染，一般發(fā)生溶菌，隨之出現(xiàn)發(fā)酵緩慢或停止，而且受噬菌體感染后，往往會反復(fù)連續(xù)感染，使生產(chǎn)無法進(jìn)行，甚至使種子全部喪失。83整理課件染噬菌體的檢測在培養(yǎng)皿上倒入培養(yǎng)生產(chǎn)菌的培養(yǎng)基〔加瓊脂〕作下層。同樣的培養(yǎng)基中參加20％～30％培養(yǎng)好的種子液，再參加疑心染噬菌體的發(fā)酵液，搖均勻后，鋪上層。培養(yǎng)過夜觀察培養(yǎng)皿上是否出現(xiàn)噬菌斑。也可以在上層培養(yǎng)基中不加疑心染噬菌體的發(fā)酵液，而將發(fā)酵液直接點(diǎn)種在上層培養(yǎng)基外表，培養(yǎng)過夜，觀察有無透明圈出現(xiàn)。84整理課件噬菌體的防治1、嚴(yán)格活菌體的排放，切斷噬菌體的“根源〞２、做好環(huán)境衛(wèi)生，消滅噬菌體和雜菌。３、認(rèn)真進(jìn)行發(fā)酵罐、補(bǔ)料系統(tǒng)的滅菌，嚴(yán)防噬菌體和雜菌進(jìn)入種子罐和發(fā)酵罐。４、抑制罐內(nèi)噬菌體的生長。噬菌體的防治是一項(xiàng)系統(tǒng)工程，具體歸納以下幾點(diǎn)：85整理課件發(fā)酵罐中污染噬菌體后的搶救A、并罐法：利用噬菌體只能在處于生長繁殖期細(xì)胞中增值的特點(diǎn)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵罐初期污染噬菌體時，將其他罐批發(fā)酵16~18h小時左右的發(fā)酵液，以等體積混合后分別發(fā)酵，利用其活力旺盛的種子，不進(jìn)行加熱滅菌，亦不需另行補(bǔ)種，便可正常發(fā)酵。B、選育抗噬菌體的菌種，或輪換使用菌種發(fā)現(xiàn)噬菌體后停攪拌、小通風(fēng)，降低pH值，立即培養(yǎng)要輪換的菌種或抗性種子，培養(yǎng)好后接入發(fā)酵罐，并補(bǔ)加1/3正常量的玉米漿、磷鹽和鎂鹽。86整理課件C、放罐重消法發(fā)現(xiàn)噬菌體后，放罐，調(diào)pH值，補(bǔ)加1/2正常量的玉米漿和1/3正常量的水解糖，適當(dāng)降低溫度重新滅菌，接入2%的種子，繼續(xù)發(fā)酵。D、罐內(nèi)滅噬菌體法：發(fā)現(xiàn)噬菌體停攪拌、小通風(fēng)，將發(fā)酵液加熱到70~80°C殺死噬菌體。冷卻后，接種發(fā)酵。87整理課件

滅菌方法

化學(xué)滅菌88整理課件物理滅菌89整理課件培養(yǎng)基滅菌的操作方式90整理課件分批操作的滅菌過程冷卻降溫：依次關(guān)閉排氣、進(jìn)氣閥。罐壓低于空氣壓力后，通入無菌空氣，夾套通冷卻水降溫通入蒸汽，加熱升溫：空氣管、夾套通入蒸汽，升溫至70℃，取樣管、放料管通入蒸汽維持保溫：120℃，罐壓0.1MPa，排氣。調(diào)節(jié)進(jìn)氣和排氣量，維持30min。91整理課件連續(xù)滅菌操作92整理課件連續(xù)滅菌滅菌過程93整理課件連續(xù)滅菌的特點(diǎn)94整理課件三、微生物代謝產(chǎn)物的生物合成初級代謝產(chǎn)物：氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)、核酸、脂類和碳水化合物等。主要滿足微生物自身的生長繁殖。次級代謝產(chǎn)物：次級代謝產(chǎn)物是由微生物代謝產(chǎn)生的中間產(chǎn)物和初級代謝產(chǎn)物合成。95整理課件從代謝控制上看，初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物都受到核內(nèi)遺傳物質(zhì)的控制。抗生素同時受到核外遺傳物質(zhì)質(zhì)粒的控制。如在灰黃鏈霉菌、卡那霉素鏈霉菌等菌種中確認(rèn)與抗生素生物合成有關(guān)的質(zhì)粒存在。通常，如果菌種的染色體發(fā)生變異，多半是致死的，可質(zhì)粒發(fā)生變異就不一定是致死的，而且可能產(chǎn)生新的次級代謝產(chǎn)物。96整理課件〔一〕初級代謝產(chǎn)物及其應(yīng)用初級代謝產(chǎn)物用途乙醇含酒精飲料中的活性成分與石油混合后，可作為汽車燃料檸檬酸食品、化學(xué)工業(yè)中多種用途丙酮丁醇溶劑氨基酸藥品、調(diào)味品核苷酸調(diào)味品多糖食品添加劑、提高油類回收率維生素食品添加劑、藥品97整理課件〔二〕次級代謝產(chǎn)物的生源和生物合成生源：次級代謝產(chǎn)物分子中構(gòu)建單位的來源。生物合成：各種構(gòu)建單位在多種酶的作用下合成各種次級代謝產(chǎn)物的過程。前體：可被菌體直接并入次級代謝產(chǎn)物分子中，而自身結(jié)構(gòu)沒有明顯改變。次級代謝中間體：進(jìn)入次級代謝途徑，被轉(zhuǎn)化成一種或多種不同的物質(zhì)，轉(zhuǎn)化物經(jīng)代謝才能形成次級代謝產(chǎn)物途徑的終產(chǎn)物。如短鏈脂肪酸，異戊二烯單位，氨基酸等。分叉中間體：代謝中間體可以用來合成初級代謝產(chǎn)物，也可以用以合成次級代謝產(chǎn)物，這種中間體稱為分叉中間體。例如：丙酮酸，乙酰輔酶A，草酰乙酸。98整理課件1.次級代謝產(chǎn)物合成的根本特征1〕次級代謝產(chǎn)物的合成具有種屬特異性。相同菌種能產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的抗生素不同微生物也能產(chǎn)生同一抗生素2〕分批發(fā)酵時，在產(chǎn)物合成期大量合成次級代謝產(chǎn)物3〕次級代謝產(chǎn)物通常是結(jié)構(gòu)相似的混合物。4〕次級代謝產(chǎn)物的合成受多基因控制。99整理課件2.次級代謝產(chǎn)物的生源聚酮體：含有多個羰基的聚合物。聚酮體的形成以起始單位為根底，與鏈的延伸單位不斷縮合和脫羧，最終形成β－多酮次甲基鏈。糖類：以葡萄糖和戊糖為前體，形成次級代謝產(chǎn)物所需要的各種糖。包括氨基糖、糖胺、核糖、環(huán)多醇和氨基環(huán)多醇等。不常見氨基酸。非核酸的嘌呤堿和嘧啶堿。吩噁嗪酮利福霉素S甲羥戊酸100整理課件3.次級代謝產(chǎn)物生物合成的根本途徑各種次級代謝產(chǎn)物以不同前體經(jīng)過不同途徑合成，再經(jīng)化學(xué)修飾形成各種結(jié)構(gòu)相似的生理活性物質(zhì)。一般次級代謝產(chǎn)物合成的根本途徑包括：前體聚合結(jié)構(gòu)修飾不同組分的裝配101整理課件前體聚合——不同生源、不同方式聚合在一起102整理課件103整理課件修飾——根本骨架上酶促反響104整理課件不同組分的裝配——新生霉素對DNA盤旋酶有很好的抑制作用，對多種癌細(xì)胞有抑制作用，并能與抗癌藥聯(lián)合應(yīng)用，逆轉(zhuǎn)抗癌藥的耐藥性。105整理課件三〕次級代謝產(chǎn)物的主要調(diào)節(jié)機(jī)制1.初級代謝對次級代謝的調(diào)節(jié)

高檸檬酸合成酶三羧酸循環(huán)106整理課件2.碳代謝物的調(diào)節(jié)速效碳源阻遏次級代謝產(chǎn)物合成。3.氮代謝物的調(diào)節(jié)以蛋白質(zhì)為氮源，可以促進(jìn)次級代謝產(chǎn)物的合成，以無機(jī)氮為氮源抑制次級代謝產(chǎn)物的合成。4.磷酸鹽的調(diào)節(jié)磷酸鹽濃度超過10mmol/L，能抑制次級代謝產(chǎn)物的合成。107整理課件5.ATP的調(diào)節(jié)——影響次級代謝產(chǎn)物合成和糖代謝酶

6.誘導(dǎo)調(diào)節(jié)和產(chǎn)物的反響調(diào)節(jié)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)——酶合成的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)反響調(diào)節(jié)——添加分叉中間體7.細(xì)胞膜通透性調(diào)節(jié)8.金屬離子和溶解氧的調(diào)節(jié)108整理課件tetracycline109整理課件四、發(fā)酵工藝條件確實(shí)定及主要控制參數(shù)110整理課件檢測儀器和主要參數(shù)111整理課件生物學(xué)檢測的主要參數(shù)和控制112整理課件113整理課件114整理課件3.發(fā)酵污染雜菌的檢測和控制種子污染培養(yǎng)基滅菌不徹底，空氣帶菌設(shè)備及其附件滲漏115整理課件物理參數(shù)的檢測與控制116整理課件對一種微生