分子克隆技術

MolecularCloning分子生物學技術基因工程（geneengineering）：將基因進行克隆，并利用克隆的基因表達、制備特定的蛋白質或多肽產物，或定向改造細胞和生物個體的特性所用的方法及相關的工作。分子克?。╩olecularcloning）:將某一特定DNA片段通過重組DNA技術插入到一個載體(如質粒和病毒等)中，然后在宿主細胞中進行自我復制所得到的大量完全相同的該DNA片段的“群體”。2主要內容第一節(jié)工具酶第二節(jié)載體第三節(jié)分子克隆的基本步驟第四節(jié)克隆基因的表達3第一節(jié)工具酶限制性核酸內切酶DNA聚合酶DNA連接酶堿性磷酸酶T4多核苷酸激酶核酸酶S14限制性核酸內切酶（restrictionendonuclease，簡稱限制酶）：是一類能識別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。第一節(jié)工具酶

一、限制性核酸內切酶5第一節(jié)工具酶

一、限制性核酸內切酶（一）限制酶的命名與分類EcoR

I產生該酶的宿主菌屬名微生物的種名

宿主菌的株或型同一菌株中不同限制酶的編號（按發(fā)現先后順序）

大腸桿菌Escherichia屬、coli種、RY13株中分離到幾種限制酶，分別表示為:EcoR

I

、EcoR

Ⅱ

、EcoR

Ⅴ等。6作用ⅠⅡⅢ表3-1三種限制性核酸內切酶的作用

酶活性

核酸內切酶核酸內切酶核酸內切酶甲基化酶甲基化酶

ATP酶

DNA解旋酶DNA鏈上的

無有有特異識別位點DNA鏈上的

無識別序列內識別序列外特異切割位點在分子克隆中

無有無的重要意義7（二）Ⅱ型限制性核酸內切酶的作用Ⅱ型限制酶能識別雙鏈DNA特異的4

6個堿基對，并在此序列內特異切割DNA。限制酶功能：根據需要在特定的位點上精確切割雙鏈DNA分子。第一節(jié)工具酶

一、限制性核酸內切酶回文結構（palindromestructure）：指雙鏈DNA分子上按對稱軸排列的反向互補序列（常為限制酶所識別）。85

——GAATTC——3

ATATGC5’3’EcoRⅠ的識別序列：對稱軸3

——CTTAAG——5

9第一節(jié)工具酶

一、限制性核酸內切酶粘性末端（stickyend）：指限制酶錯位切開兩條對稱軸互補DNA雙鏈所產生的末端。平末端（bluntend）：指限制酶平齊切開兩條對稱軸互補DNA雙鏈所產生的末端?！狦AATTC——CTTAAG—EcoRⅠ—CCCGGG——GGGCCC—SmaⅠ1011第一節(jié)工具酶

一、限制性核酸內切酶同工異源酶（isoschizomers）:來源不同，但能識別和切割同一位點的酶稱為。

同尾酶（isocaudarner）：指有些限制性內切酶識別序列不同，可產生相同的粘性末端

如：BamHⅠ和BstⅠ（GGATCC）

XhoⅠ和

PaeR7（CTCGAG）如：

BamHⅠ（G

GATC

C）

Sau3AⅠ（N

GATC

N）。

由此產生的DNA片段可借粘性末端相互連接，在DNA重組時具有更大的靈活性。12（一）DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（E.ColiDNApolymeraseⅠ）是單一多肽鏈的多功能酶，分子量為109kD，它具有3種酶活性：

①5

→3

DNA聚合酶活性。②3

→5

核酸外切酶活性。③5

→3

核酸外切酶活性。第一節(jié)工具酶

二、DNA聚合酶13Klenow片段的主要用途：

①補齊雙鏈DNA的3

末端，同時可使3

末端DNA標記上同位素。②cDNA克隆中，合成cDNA第二鏈。③DNA序列分析。第一節(jié)工具酶

二、DNA聚合酶5

→3

外切酶5

→3

聚合酶3

→5

外切酶

DNA聚合酶Ⅰ

(103kD)35kD(小)68kD(大)CNKlenow片段14（二）TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶（簡稱Taq酶）是一種耐熱的DNA聚合酶，分子量為65Kd，最佳作用溫度是70~80℃，Taq酶具有5

→3

聚合酶活性和依賴于聚合作用的5

→3

外切酶活性。TaqDNA聚合酶可用于DNA測序及通過聚合酶鏈反應（PCR）對DNA分子的特定序列進行體外擴增。

第一節(jié)工具酶

二、DNA聚合酶15（三）逆轉錄酶逆轉錄酶（reversetranscriptase）是依賴RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板，4種dNTP為底物，催化合成DNA，此過程稱為逆轉錄過程。逆轉錄酶是多功能酶。第一節(jié)工具酶

二、DNA聚合酶①RNA指導的DNA聚合酶活性（RDDP）②核糖核酸酶H活性（RNaseH）③DNA聚合酶活性（DDDP）逆轉錄酶的作用：165

3

3

5

RNA(用表示)RNA-DNA

雜化分子3

5

RNase（核酸酶H活性)

DDDP（DNA聚合酶活性）

4種dNTP

RDDP（逆轉錄酶）引物、4種dNTP

病毒雙鏈DNA用

表示）（cDNA第二鏈(complementaryDNA，cDNA

)與病毒RNA互補的DNA(用表示)5

3

3

5

5

3

5

3

17（四）末端脫氧核苷酰轉移酶末端脫氧核苷酰轉移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT，簡稱末端轉移酶）：分子量為60Kd，在二價陽離子存在下，催化脫氧核糖核苷酸轉移到單鏈或雙鏈DNA分子的3

末端-OH上。第一節(jié)工具酶

二、DNA聚合酶①在載體或目的基因3

末端加上互補的同質多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重組連接。②用于DNA3

末端的同位素探針標記。末端轉移酶的功能主要有：18(A、G、C、T)nOH5′3′5′3′OH5′3′5′3′(A、G、C、T)nMg2+dNTPnppiMg2+dNTPnppi5′3′OH5′3′OH

5′3′5′3′(A、G、C、T)nCo2+dNTPnppiCo2+dNTPnppi（1）底物是單鏈DNA或有3

突出末端的雙鏈DNA，需要Mg2+。（2）底物是平端或3

凹端的雙鏈DNA，需要Co2+。(A、G、C、T)n19DNA連接酶（DNAligase）：稱為基因工程的縫紉針，它在DNA重組中的主要功能是催化兩個互補粘性末端或平末端雙鏈DNA分子的5

磷酸基團與3

羥基形成磷酸二酯鍵，將具有相同粘性末端或平末端的DNA連接起來，實現DNA體外重組。DNA連接酶包括大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA連接酶兩種類型。第一節(jié)工具酶

三、DNA連接酶20堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的5

-磷酸基團。主要用途有：①除去DNA片段上的5

磷酸以防自身連接。②在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素標記前，從RNA或DNA上除去5

端的磷酸。第一節(jié)工具酶

四、堿性磷酸酶

5

-pCpGpC┅┅-OH3

堿性磷酸酶5

-CpGpC┅┅-OH3

5

-p3

-HO5

-HO3

-HO21第一節(jié)工具酶

五、T4多核苷酸激酶5’-

CpGpC┅┅-OH3’p+ADP+ATP5’-CpGpC┅┅-OH3’T4多核苷酸激酶①前向反應：②交換反應：5’-CpGpC┅┅-OH3’+ADP[

-32P]dATP

二硫蘇糖醇,Mg2+過量ADPT4多核苷酸激酶p*

+ATP22核酸酶S1可水解雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交分子中的單鏈部分。其主要作用有：①除去粘性末端以產生平末端。②除去cDNA合成時形成的發(fā)夾結構。③分析RNA的莖環(huán)結構和DNA-RNA分子的雜交情況。第一節(jié)工具酶

六、核酸酶S1核酸酶S1核酸酶S1核酸酶S1+23第二節(jié)載體克隆載體表達載體穿梭載體24載體（vector）：指能攜帶外源DNA片段導入宿主細胞進行擴增或表達的工具。載體的本質為DNA。第二節(jié)載體

一、克隆載體制備的目的基因或外源性DNA片段必須與合適的載體連接形成重組體，才能進入受體細胞并進行復制和表達。常用的載體有：質粒、噬菌體、粘粒、酵母質粒和病毒等?？寺≥d體：能將載體攜帶的外源基因（目的基因）在受體細胞中復制擴增并產生足夠量目的基因的載體。25載體應具備的特征：①能自我復制并具較高的拷貝數。分子量一般<10Kb。②帶有遺傳篩選標記。③有適當的限制酶切位點，便于外源基因的插入和篩選。第二節(jié)載體

一、克隆載體多克隆位點（multiplecloningsites，MCS）：載體上具有的多個限制酶的單一切點（在載體其它部位無這些酶的相同切點）26（一）質粒載體第二節(jié)載體

一、克隆載體質粒（plasmid）：是指細菌染色體以外的小分子環(huán)狀雙鏈DNA，能自我復制和表達其攜帶的遺傳信息。27

復制起始點抗藥基因抗藥基因圖4-5pBR322質粒的物理圖譜pBR322質粒載體28pBR322質粒是由一系列大腸桿菌質粒DNA通過DNA重組技術構建而成的雙鏈克隆載體，長為4.36Kb。它含有一個能保證高拷貝自我復制的復制起始點（Ori），并裝有四環(huán)素抗性（Tetr）基因和氨芐青霉素抗性（Ampr）基因供菌落篩選。在這兩個抗性基因中分別含有BamHI和PstI等限制酶的單一酶切位點，用于插入外源DNA片段。如有外源基因的插入，會導致這些標志性基因的失活。29圖4-6pUC質粒物理圖譜

pUC18、pUC19質粒載體30pUC系列載體是由pBR322質粒和M13噬菌體重組構建而成的雙鏈DNA質粒載體。pUC18和pUC19質粒長約2.69Kb，除多克隆位點互為相反方向排列外，其它序列均相同。pUC質粒含Ampr，可供菌落篩選。載體中裝入一個來自大腸桿菌乳糖操縱子的DNA片段（lacZ

基因），該基因編碼

-半乳糖苷酶氨基端的一個片段，IPTG可誘導此片段合成，而此片段能與宿主細胞所編碼的缺陷型

-半乳糖苷酶實現基因內互補（

-互補），形成完整的

-半乳糖苷酶31第二節(jié)載體

一、克隆載體（二）噬菌體載體（三）粘性質粒(cosmid)（四）酵母人工染色體（五）動物細胞基因克隆的載體

猿猴空泡病毒40（SV40）載體、腺病毒載體和逆轉錄病毒載體32外源目的基因在新宿主細胞中是否克隆成功，是通過鑒定克隆是否表達的方法來證實，即產生克隆基因所編碼的蛋白質，其每個環(huán)節(jié)都至關重要。真核基因在原核細胞中表達需要有效轉錄及一系列調控元件，必須保證外源基因－－插入方向的正確性；受原核啟動子的控制；必須能在大腸桿菌中有效轉錄和有效翻譯?；虮磉_、合成有功能的蛋白質依賴于基因的有效轉錄、mRNA正確的翻譯和翻譯后加工。第二節(jié)載體

二、表達載體表達載體是指能將外源基因在受體細胞中有效轉錄和正確翻譯的載體，帶有表達所需的各種元件。33（一）原核細胞表達載體原核細胞的表達載體主要是大腸桿菌表達載體。外源基因在原核細胞中表達需要重要調控元件。大腸桿菌表達載體是在克隆載體的基礎上導入表達系統(tǒng)調控元件：啟動子—核糖體結合位點—克隆位點—轉錄終止信號。第二節(jié)載體

二、表達載體34第二節(jié)載體

二、表達載體5

—TTGACA——TATAAT———//——3

-35區(qū)-10區(qū)轉錄起始點PribnowboxDNA

如乳糖啟動子（Lac）、色氨酸啟動子（Trp）、Tac啟動子（Trp-Lac）以及PL和PR啟動子等。原核細胞啟動子示意圖（一）原核細胞表達載體1.啟動子（promoter）：35（一）原核細胞表達載體

2.SD序列第二節(jié)載體

二、表達載體mRNA36（一）原核細胞表達載體

終止子：一個基因的3

末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶識別并停止轉錄的功能。該序列含有一段富含A/T和富含G/C的回文對稱結構，終止子轉錄后形成的RNA具有莖環(huán)狀局部二級結構。第二節(jié)載體

二、表達載體37（二）哺乳動物細胞表達載體真核表達載體的真核表達元件有：啟動子/增強子—克隆位點—終止位點和加polyA信號。

1．原核DNA序列包括能在大腸桿菌中自身復制的復制子和抗藥基因的篩選標記。

2．啟動子轉錄起始位點上游25~30bp有富含AT的TATA框，TATA框的上游約100~200bp處為上游啟動子元件。

3．增強子（enhancer）是一類顯著提高基因轉錄效率的順式作用元件。

4．終止子和加polyA信號。第二節(jié)載體

二、表達載體38第二節(jié)載體

三、穿梭載體穿梭載體（shuttlevector）：人工構建的既帶有原核細胞的復制元件、又帶有真核細胞的復制元件，既能在原核細胞中復制、又能在真核細胞中復制，能夠在兩類不同宿主中復制、擴增和選擇的載體。39目的基因的制備載體的選擇和制備目的基因和載體連接重組DNA導入受體細胞目的基因的篩選和鑒定第三節(jié)分子克隆的基本步驟40連接含重組子的陽性克隆載體+目的基因轉化、篩選和鑒定陽性克隆DNA重組體+受體細胞圖3-10DNA分子克隆的基本步驟——分、切、接、轉、篩41

（一）從基因文庫中獲?。ǘ┠孓D錄法（三）人工合成DNA片段（四）直接從染色體DNA中分離目的基因第三節(jié)分子克隆的基本步驟

一、目的基因的獲取42制備的目的基因或外源性DNA片段必須與合適的載體連接，才能進入受體細胞進行復制和表達。載體大都經過改造，攜帶有某些選擇性標記和克隆位點的遺傳信息等。在常用的克隆載體中加入一些與表達調控有關的元件（DNA序列）即成為表達載體，這些載體不僅可以攜帶外源基因片段進入宿主細胞，而且還可以使外源基因在宿主細胞中表達。常用的宿主細胞是大腸桿菌。

第三節(jié)分子克隆的基本步驟

二、載體的選擇43(一)粘性末端連接第二節(jié)載體

三、目的基因和載體的連接本法適用于在質粒和目的基因上有相同單或雙酶切位點44圖3-11粘性末端DNA重組體的構建3

HO-G━━━━━CTTAA-p5

5

p-AATTC━━━━━G-OH

3

3

HO-G━━━━━CTTAA-p5

5

p-AATTC━━━━━

G-OH3

質粒目的基因

━━━━━━━━━━━━━━━━

目的基因和載體連接EcoRⅠEcoRⅠ

堿性磷酸酶3

HO-G━━━━━CTTAA-OH5

5

HO-AATTC━━━━━G-OH

3

退火DNA連接酶

3

HO-G━━━━━CTTAAG━━━━━CTTAA-p5

5

p–AATTC━━━━━GAATTC━━━━━

G-OH3

45第二節(jié)載體

三、目的基因和載體酶切與連接(二)平末端連接T4DNA連接酶、人工接頭、同聚尾連接46第二節(jié)載體

四、重組DNA導入受體細胞

目的基因與載體在體外連接成重組體后，需先導入受體細胞，常用的受體細胞是大腸桿菌。制備感受態(tài)細胞的基本方法有兩種：

1.CaCl2處理，增加大腸桿菌細胞膜通透性。

2.體外包裝DNA重組體，再轉染噬菌體。感受態(tài)細胞(competentcell)：細胞膜結構改變、通透性增加并具有攝取外源DNA能力的細胞。轉化（transformation）：將重組的DNA分子引入細菌(原核細胞),使其在細菌體內擴增及表達的過程。47（一）根據載體的性狀變化進行篩選

1．根據載體的抗藥性標志篩選

大多數質粒載體帶有抗生素抗性標記的特征（如Ampr

、Tetr等）當帶有完整抗性基因的載體轉化無抗性細菌后，被轉化的陽性菌獲得抗生素抗性基因而存活并形成噬菌斑，未轉化菌不能存活，但應排除未重組的空