兒童膿皰瘡溶血性鏈球菌的分離及其抗菌藥物敏感性研究

膿皰是兒童常見的感染性疾病。主要病原體為金色霉（sa）和a組溶血性球菌。答：唾液腺炎和答：溶血性球菌是引起兒童皮膚感染的重要病原體。除了引起喉嚨炎、嗜水性熱和敗血癥等非侵行性疾病外，一些情況下還可能導致致命的肌肉感染和致命休克綜合征，如致命性肌腱炎和致命的減熱綜合征。gas后延遲性gas感染后的非感染性疾病，如急性風濕熱和球形尿道感染后的尿失禁。青霉素是治療GAS感染的首選藥物,對青霉素過敏的患者亦可選用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。近年來關(guān)于該菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的報道較多,國內(nèi)已經(jīng)報道了該菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的高耐藥率,但由A組β溶血性鏈球菌引起的皮膚感染資料較為有限,為此,本文對北京兒童醫(yī)院皮膚科2003—2008年的膿皰瘡患兒分離出的GAS進行了耐藥及emm分型研究。1數(shù)據(jù)和方法1.1病例選擇及資料收集選取2003-2008年北京兒童醫(yī)院門診就診的膿皰瘡患兒1735例,自皮損部位分離GAS共計52株,入選病例詳細記錄性別、年齡、就診日期、皮損初發(fā)部位、取材部位、皮損誘發(fā)因素、合并癥等。1.2桿菌肽檢測菌株抗血清分型將皮膚膿液標本接種于5%羊血培養(yǎng)基,挑選B溶血菌落進行桿菌肽檢測,陽性株采用Lancefield族特異性抗血清分型以確定是否為GAS。1.3實驗數(shù)據(jù)的采集用瓊脂稀釋法對52株GAS進行最小抑菌濃度(MIC)測定,抗菌藥物種類包括青霉素、頭孢拉啶、紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素、克林霉素、氯霉素、四環(huán)素和氧氟沙星,均購自中國藥品生物制品檢定所。以質(zhì)控菌株肺炎鏈球菌ATCCA49619作為瓊脂稀釋法藥敏試驗質(zhì)控菌株,在每次試驗前均做質(zhì)控對照,當其MIC值在美國臨床實驗室國家標準委員會規(guī)定的范圍內(nèi),可以使用本次實驗數(shù)據(jù)進行分析?？股孛舾袑嶒灲Y(jié)果判定根據(jù)CLSI,收集的菌株經(jīng)過2次轉(zhuǎn)種,血平皿上孵育18~24h的新鮮GAS菌株中挑取適量菌落至生理鹽水中,制成懸液調(diào)至0.5麥氏濁度單位,多點接種器蘸取0.5麥氏濁度單位的GAS懸濁液1~2mL接種于5%羊血的MH培養(yǎng)基上(Mueller-Hinto瓊脂+5%羊血的培養(yǎng)基)。1.4藥基因擴增引物大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥基因檢測提取52株GAS的DNA,用PCR方法對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥基因ermB、ermA、mefA,進行擴增,所用引物見表1。PCR條件:94℃預變性1min后,94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,30個循環(huán)后72℃再延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物1.0%~1.5%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色成像。1.5as-to1.5.1gas蛋白n末端的pcr擴增emm基因的擴增采用根據(jù)emm基因5’端堿基組成特點研究出來的引物:(F)TATTGGCTTAGAAAATTAA(R)GCAAGTTGTTCAGCTTGTTT對GAS的M蛋白N末端進行PCR擴增。PCR反應(yīng):50反應(yīng)體系中含有200pmol/L,dNTP濃度為20μmol/L的引物l、2各1μL,2UTaq酶,25μgDNA模板,30個循環(huán):94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸1.5min,最后1循環(huán)72℃引物延伸5min。1.5.2pcr產(chǎn)物的測量序列以測序引物TATTGGCTTAGAAATTAAAAACAGG為引物直接測序。委托華大基因生物技術(shù)有限公司進行操作。1.5.3序列與gebak中序列的同源性序列分析通過用blast軟件分析所測序列與GenBank中序列的同源性,以判斷emm基因分型的結(jié)果,根據(jù)DNA序列同源性≥95%判為同一基因型的標準。1.6耐藥率及emm分型分布的比較用SPSS11.5軟件進行數(shù)據(jù)處理。耐藥率及emm分型分布比較采用四格表χ2檢驗及Fisher精確比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1炎性毒性感染本文收集的52例患兒有1例資料缺失,其余51例,年齡1~8歲,中位年齡4歲。51例中,男35例(68.6%),女16例(31.3%)。膿皰瘡發(fā)生與季節(jié)相關(guān),高峰時間出現(xiàn)在12月及6月、7月,誘發(fā)因素主要為上呼吸道感染及瘙癢性皮膚病等,皮損好發(fā)部位依次為面部、四肢和軀干。并發(fā)燙傷樣葡萄球菌感染SSSS2例,占3.8%;52例均未見并發(fā)腎炎、腦膜炎和敗血癥的患兒。2.2新生兒水腫分離結(jié)果6年中,在1735例膿皰瘡患兒皮損處共培養(yǎng)出A組溶血性鏈球菌52株,分離率為3.0%。其中在2003年,從235例患兒皮損分離出單純SA219株,占93.2%,單純GABHS9例,占0.4%;沒有發(fā)現(xiàn)SA與GABHS混合感染,還有15例為其他細菌,占6.5%。在2004年,從210例患兒皮損分離出單純SA184株,占87.6%,單純GABHS10例,占4.8%,SA與GABHS混合感染3例,占1.4%,還有13例為其他細菌,占6.2%。在2005年,從478例患兒皮損分離出單純SA392株,占82.2%,單純GABHS23例,占4.8%;沒有發(fā)現(xiàn)SA與GABHS混合感染(0%),還有13例為其他細菌,占6.2%。在2006年,從562例患兒皮損分離出單純SA523株,占93.1%,單純GABHS13例,占2.7%,SA與GABHS混合感染1例,占0.2%,還有23例為其他細菌,占4.1%。在2007年,從104例患兒皮損分離出單純SA94株,占90.4%,單純GABHS5例,占4.8%,沒有發(fā)現(xiàn)SA與GABHS混合感染,還有5例為其他細菌,占4.8%。在2008年,從146例患兒皮損分離出單純SA116株,占79.5%,單純GABHS1例,占0.7%,SA與GABHS混合感染1例,占0.7%,還有28例為其他細菌,占19.2%。2.3藥物過敏試驗的結(jié)果52株GAS對常用抗菌藥物的耐藥情況,見表2。2.4erma和erma同時存在2003—2008年52株紅霉素耐藥分離株中,ermB陽性菌株占分離株總數(shù)的92.3%(48/52),ermA占7.7%(4/52),未發(fā)現(xiàn)ermB及ermA同時存在,無mefA陽性株。2.5早熟型別,最大的emm有在分離的52株菌株中,emm12所占比例最大,為53.85%,隨后是emm1,為36.54%,少見型別有emm4.0(1/52,1.92%),emm8.0(1/52,1.92%),emm22.0(1/52,1.92%),emm101(1/52,1.92%)和emm114(1/52,1.92%)。3討論3.1兒童細胞中g(shù)as的分離率其病原菌隨年代有何變化。2000年馬琳等從246例患兒皮損分離出病原菌233株。其中單純SA214例,占87.0%;單純GABHS4例,占1.6%;SA與GABHS混合感染5例,占2%。2004年鄧秋連等對2086例膿皰瘡患兒分離到的2066株病原菌進行耐藥性分析,結(jié)果顯示,兒童膿皰瘡病原菌主要為金黃色葡萄球菌,占96.3%,其次是A組溶血性鏈球菌,占2.2%。在2010年陳仕勝等報道從253例患者皮損處、咽拭子、血液共培養(yǎng)出病原菌216株,其中A組溶血性鏈球菌5株,占2.3%,葡萄球菌211株,占97.7%。本文在1735菌中發(fā)現(xiàn)GAS52例,總分離率為3.0%,其中每年的分離率波動在0.4%~4.8%,分離率的不同可能與取材季節(jié)及數(shù)量多少有關(guān),而GAS對頭孢類藥物仍敏感,此類抗生素的早期或不合理使用,均可影響其分離率。因此,引起北京地區(qū)2003至2008年膿皰瘡的主要病原菌仍為金黃色葡萄球菌,而A組β-溶血性鏈球菌仍為引起膿皰瘡的較常見病原菌。3.2gas的耐藥情況細菌耐藥問題已成為世界性難題,不同國家不同地區(qū)GAS對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥率有很大差別,據(jù)報道在韓國GAS菌株對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素呈現(xiàn)明顯增長的趨勢。在匹茲堡的一項研究顯示,GAS菌株對紅霉素的耐藥率為48%,在美國為9.6%,在意大利為35.8%。而在我國,近十余年來GAS對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性不斷增長,GAS對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥率顯著高于其他國家,王輝等報道2002至2003年中國社區(qū)呼吸道感染GAS對阿奇霉素的耐藥率高于60%,在馮麗娟等報道中,10余年間GAS對紅霉素耐藥由79.7%升至94%,對克林霉素的耐藥由75.4%升至96.9%,在2008年梁云梅等在對重慶北京兩地分離自猩紅熱患者GAS對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥率高達97.9%;有研究人員發(fā)現(xiàn),健康患兒咽部攜帶的GAS對大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥率96.8%。在本研究中,來自北京地區(qū)門診膿皰瘡患兒皮損部位分離的52株GAS全部對紅霉素耐藥,且呈現(xiàn)高度耐藥,MIC50、MIC90均大于256mg/L,遠高于以往國內(nèi)外報道,抗生素耐藥已經(jīng)到了警戒的程度,表明北京地區(qū)兒童GAS菌株對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性相當嚴重,這與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在門診消耗量大有直接關(guān)系。以往研究已表明,引起紅霉素耐藥主要有2種機制:(1)細菌攜帶ermB,該基因編碼甲基化酶,甲基比酶對細菌核糖體23SRNA甲基化,使核糖體結(jié)構(gòu)改變與藥物的親和力下降,從而產(chǎn)生了耐藥;(2)另一種機制是攜帶mefA基因,編碼外排泵膜相關(guān)蛋白,形成主動外排機制,把抗生素泵出細胞外產(chǎn)生耐藥。在歐洲國家中,例如美國、希臘、加拿大的GAS是以攜帶mefA為主,在本研究中,52株GAS中,有48株表達ermB基因,在我們之前的研究相同,而與國外文獻報道有明顯差別。造成國家、地區(qū)間耐藥模式和機制差異的可能原因是流行菌株血清型不同以及不同耐藥克隆株流行等,而GAS的ermB常有結(jié)合性的轉(zhuǎn)座子攜帶,并可在細菌之間廣泛傳播,這也是紅霉素廣泛耐藥的原因之一。青霉素是治療GAS感染的首選藥物,過去70年來一直認為青霉素的MIC值沒有增高,本研究中GAS對青霉素及頭孢類抗生素仍然敏感,仍可作為一線用藥。3.3gas菌株的emm分型M蛋白是GAS主要的毒力因子,到目前為止,已發(fā)現(xiàn)120余種根編碼M蛋白的emm基因。因此,GAS分型在流行病學研究方面有重要意義。不同國家非侵襲性GAS感染emm基因型別各異,在印度與咽部疾患有關(guān)的GAS的emm型別最多見于11,77和81,而與皮膚感染有關(guān)的GAS卻多見于emm77,emm44,在西班牙最常見的型別為emm1,emm3,emm4,emm12和emm28。而在我國廣州地區(qū)引起感染性咽炎、扁桃體炎、膿皮病的GAS菌株emm分型,最常見emm1、emm18、emm12,而在Zheng等的研究中,對引起腎炎的68株GAS進行emm分型,最常見者為emm12,emm60,emm63和emm95。在我們之前的研究中,對猩紅熱、健康攜帶者以及咽扁株的GAS進行emm分型時,最常見的為emm12,emm1,emm22。由此可見,不同emm基因型別可導致不同疾病,且有國家、地區(qū)差異。本次研究顯示,GAS以emm12所占比例為最大,(53.85%),隨后是emm