elispo檢測人乳頭瘤病毒感染后清除者外周血中抗原特異性記憶細(xì)胞

人類乳頭瘤病毒（pv）是由嗜上皮組織的雙鏈dna病毒組成的。HPV僅感染局部的皮膚和黏膜上皮細(xì)胞,不入血,因而外周血中抗原特異性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量少,抗原特異性記憶T細(xì)胞的數(shù)量更少。本研究收集HPV自發(fā)清除者(病毒清除后74個月)外周血單個核細(xì)胞,抗原肽刺激后,采用ELISPOT方法,檢測記憶T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力,以明確外周血中記憶T細(xì)胞的數(shù)量和功能。該結(jié)果可為后續(xù)檢測HPV持續(xù)感染者或?qū)m頸癌患者體內(nèi)抗原特異性的記憶T細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1il-2、ifn-單克隆抗體和生物素標(biāo)記的結(jié)構(gòu)表征RPMI1640培養(yǎng)基、人血清、Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購自Fisher公司;Multiscreen96孔板購自美國Millipore公司;IL-2、IFN-γ單克隆抗體和生物素標(biāo)記的Anti-IFN-γ單克隆抗體購自瑞典Mabtech公司;avidin-boundbiotinylatedhorseradishperoxidase購自VectorLaboratories公司;ELISPOT分析儀為CellTechnology公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1ficoll細(xì)胞分離HPV自發(fā)清除后74個月收集靜脈血40mL,Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC),計數(shù)凍存。1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和il-2前期實驗已經(jīng)證實此病毒自發(fā)清除者體內(nèi)存在HPV16E6133-142表位特異性T細(xì)胞。凍存的PBMC常規(guī)復(fù)蘇,檢測細(xì)胞活性,用含10%人血清的RPMI1640培養(yǎng)基(RP-10H)過夜培養(yǎng)細(xì)胞(濃度為2×106/mL)。收集后計數(shù)細(xì)胞,將細(xì)胞以1×106/mL/孔置于24孔板中,應(yīng)用抗原肽(HPV16E6133-142;10μmol/L)刺激PBMC細(xì)胞,置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3天,每孔加IL-2(1800U/mL)。第7天,每孔加含IL-2的RP-10H1mL。第10天,收集細(xì)胞,用RP-10H洗滌細(xì)胞,去除抗原肽和IL-2,RP-10H繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。第11天,細(xì)胞計數(shù)后進(jìn)行ELISPOT實驗。1.2.3elispot法檢測相關(guān)免疫因子t細(xì)胞中表達(dá)抗體的表達(dá)應(yīng)用ELISPOT方法,以EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴母細(xì)胞系(lymphoblastoidcellline,LCL)作為抗原遞呈細(xì)胞(antigenpresentingcells,APC),以HPV16E6133-142為抗原,檢測未經(jīng)抗原刺激的PBMC和經(jīng)抗原刺激11d的PBMC中分泌產(chǎn)生IFN-γ的抗原特異性T細(xì)胞,同時設(shè)置陽性和陰性對照。ELISPOT步驟參考文獻(xiàn)。用IFN-γ單克隆抗體(5μg/mL)包被Multiscreen96孔板,4℃冰箱中過夜。次日棄包被液,PBS洗3次。用含5%人血清的RPMI1640培養(yǎng)基(RP-5H;50μL/孔)37℃封閉2h。每孔加入50μLLCL細(xì)胞(5×105/孔)、50μLPBMC(5×104/孔),50μLHPVE6133-142(10μmol/L),實驗設(shè)陽性(PHA)和陰性對照(RP-5H)。每一條件設(shè)3個平行孔。平板置37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜。PBS洗3次后,加入生物素標(biāo)記的Anti-IFN-γ單克隆抗體(1μg/mL),37℃孵育2h。PBS洗3次后,加入avidin-boundbiotinylatedhorseradishperoxidase,37℃孵育1h。PBS洗3次后,diaminobenzene顯色。去離子水終止顯色。ELISPOT分析儀計數(shù)斑點數(shù)量。計算每一條件斑點數(shù)量的平均值作圖。2結(jié)果與分析2.1出現(xiàn)的細(xì)胞數(shù)常規(guī)復(fù)蘇PBMC,過夜培養(yǎng)后,計數(shù)細(xì)胞,活細(xì)胞數(shù)為4.1×105,抗原肽刺激10d后,細(xì)胞數(shù)增加為4.2×106,為抗原刺激前細(xì)胞數(shù)的10.2倍。第11天,細(xì)胞數(shù)為4.65×106,為抗原刺激前細(xì)胞數(shù)的11.3倍。2.2apc知識的表達(dá)ELISPOT結(jié)果顯示,PBMC中的記憶T細(xì)胞經(jīng)抗原刺激后活化為效應(yīng)細(xì)胞,能夠識別APC遞呈的抗原肽HPV16E6133-142,并分泌IFN-γ(圖1)。而未經(jīng)抗原刺激的PBMC不能識別APC遞呈的抗原肽(圖2)。通過計數(shù)斑點數(shù)量,推算PBMC中抗原特異性的記憶T細(xì)胞的頻數(shù)。公式如下:記憶T細(xì)胞的頻數(shù)=(計數(shù)抗原肽刺激孔斑點數(shù)量-陰性對照孔斑點數(shù)量)÷PBMC數(shù)量÷細(xì)胞增加倍數(shù)。此HPV自發(fā)清除者外周血中抗原特異性的記憶T細(xì)胞的頻數(shù)為(69-30)÷(5×104)÷11.3=0.007%。3抗原刺激激活pbmc中的記憶t細(xì)胞機(jī)體內(nèi)的初始T細(xì)胞識別抗原遞呈細(xì)胞遞呈的抗原后,可被激活,分化為效應(yīng)T細(xì)胞。當(dāng)機(jī)體清除抗原,效應(yīng)細(xì)胞中的一部分可分化轉(zhuǎn)為記憶T細(xì)胞。當(dāng)再次接觸相同抗原時,抗原特異性的記憶T細(xì)胞可迅速增殖分化為效應(yīng)T細(xì)胞。相較于初始T細(xì)胞,記憶T細(xì)胞具有較低的活化閾值和較強(qiáng)的效應(yīng)功能。因此在防止病原菌的再感染過程中,記憶T細(xì)胞反應(yīng)迅速,功能強(qiáng)大,發(fā)揮重要作用。體外抗原刺激可活化PBMC中的記憶T細(xì)胞。本實驗采用已經(jīng)鑒定的表位肽HPV16E6133-142刺激HPV自發(fā)清除者(HPV清除后74個月)的PBMC,使其中的記憶T細(xì)胞增殖分化為效應(yīng)細(xì)胞。通過細(xì)胞計數(shù),發(fā)現(xiàn)抗原刺激11d后,細(xì)胞數(shù)量增加11.3倍,表明PBMC中含有HPV16E6133-142特異性的記憶T細(xì)胞,此T細(xì)胞經(jīng)特異性抗原肽激活后,分化為效應(yīng)細(xì)胞,細(xì)胞分裂增殖,數(shù)量增加。ELISPOT可以從100萬個細(xì)胞中檢測出單個分泌細(xì)胞,具有較高的可靠性、重復(fù)性及敏感性。本研究應(yīng)用ELIS