喜炎平注射液對(duì)lps誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)釋放炎性因子的抑制作用

喜炎平注射液是一種穿心蓮注射液。臨床上廣泛用于治療急性上呼吸道感染、病毒性肺炎和兒童支氣管炎肺炎，療效顯著。穿琥寧注射液也屬穿心蓮制劑,臨床上用于同類感染性炎癥疾病的治療,如急性上呼吸道感染、病毒性肺炎。但隨著兩種藥物在臨床上的應(yīng)用,有關(guān)其不良反應(yīng)的報(bào)道逐年增多,本研究以穿琥寧注射液為對(duì)照藥品,檢測(cè)了喜炎平注射液的體外細(xì)胞毒性以及對(duì)多種炎性細(xì)胞因子如NO、TNF-α及IL-6的抑制作用,旨在探討喜炎平注射液的抗炎作用與機(jī)理。1材料和方法1.1藥品、注射液白砂糖喜炎平注射液為江西青峰藥業(yè)有限公司產(chǎn)品,規(guī)格:25mg/ml,批號(hào):Z20026249;穿琥寧注射液為揚(yáng)州中寶制藥有限公司生產(chǎn),規(guī)格:20mg/ml,批號(hào):H20046071。兩種藥物均以生理鹽水稀釋至相同濃度,于-4℃冷藏備用。1.2細(xì)胞培養(yǎng)及生長(zhǎng)小鼠單核巨噬細(xì)胞株RAW264.7購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)(ATCC),用含10%胎牛血清、100μg/ml鏈霉素,100單位/ml青霉素的RPMI1640培養(yǎng)液于37℃CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),隔天傳代,細(xì)胞于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期呈半貼壁狀態(tài)生長(zhǎng)。1.3resco公司的紡粘設(shè)備RPMI1640培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司;胰蛋白酶Amresco公司;小鼠TNF-αELISA試劑盒、IL-6ELISA試劑盒購(gòu)自晶美生物有限公司(R&D公司產(chǎn)品,國(guó)內(nèi)分裝);LPS(Escherichiacoli0111:B4)和MTT為Sigma公司產(chǎn)品。其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.4林巴公司的在線培養(yǎng)箱CKX31型倒置顯微鏡(菲律賓奧林巴士公司);恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek集團(tuán))。1.5方法1.5.1dmso和dmso最佳添加量的確定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化,制成每毫升含5×105個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(每孔200μl),每組設(shè)3個(gè)平行孔。培養(yǎng)1h后分別加入不同濃度的喜炎平或穿琥寧注射液及LPS(終濃度1μg/ml),同時(shí)設(shè)LPS組和空白對(duì)照組,置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,于每孔加入8μlMTT(終濃度200μg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去上清,吸干殘留液,每孔加入DMSO100μl,振搖至生成的藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶完全溶解后,以630nm為參比波長(zhǎng),用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處的吸光值(A570)。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=100×(1-實(shí)驗(yàn)組平均A570值/空白對(duì)照組平均A570值)1.5.2gwells試劑法將每毫升含5×105個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(每孔200μl),每組設(shè)3個(gè)平行孔。培養(yǎng)1h后分別加入不同濃度的喜炎平或穿琥寧注射液及LPS(終濃度1μg/ml),同時(shí)設(shè)LPS組和空白對(duì)照組,置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,吸取培養(yǎng)液上清100μl至酶標(biāo)板中,加入等體積的Griess試劑(Griess試劑A:1g/LN-萘乙二胺鹽酸鹽;Griess試劑B:體積分?jǐn)?shù)φ(H3PO4)=5%,10g/L對(duì)氨基苯磺酰胺。使用前等體積混合試劑A和B),室溫反應(yīng)5min后測(cè)定540nm的吸光值。用濃度為0、1、2、5、10、20、50、100μmol/L的NaNO2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO-2的濃度以及對(duì)NO釋放的抑制率。1.5.3平行孔的設(shè)置將每毫升含5×105個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(每孔200μl),每組設(shè)3個(gè)平行孔。培養(yǎng)1h后分別加入不同濃度的喜炎平或穿琥寧注射液及LPS(終濃度1μg/ml),同時(shí)設(shè)LPS組和空白對(duì)照組,置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后收集細(xì)胞上清液,按照IL-6ELISA試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行測(cè)定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組培養(yǎng)上清中IL-6的濃度。1.5.4elisa檢測(cè)tnf-表達(dá)接種細(xì)胞、加藥處理同上。收集培養(yǎng)6h后的細(xì)胞上清液,按照TNF-αELISA試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行測(cè)定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組樣品中TNF-α的濃度。2結(jié)果2.1外周血細(xì)胞核的存活率喜炎平及穿琥寧注射液在30～150μg/ml的濃度范圍內(nèi),對(duì)RAW264.7細(xì)胞的正常增殖抑制作用不顯著,巨噬細(xì)胞的存活率均大于85%。但高濃度下(200μg/ml)作用24h后,喜炎平組細(xì)胞的存活率為84.52%,穿琥寧組細(xì)胞的存活率為73.87%,表明高濃度的喜炎平及穿琥寧注射液可輕微抑制RAW264.7細(xì)胞的正常增殖,且喜炎平的細(xì)胞毒性小于穿琥寧,如圖1。2.2lps誘導(dǎo)的wol-4細(xì)胞炎性介質(zhì)分離空白組細(xì)胞上清中檢測(cè)到的NO濃度非常低,僅為3.96μmol/L,在1μg/ml的LPS刺激下,巨噬細(xì)胞釋放出大量的NO(18.75μmol/L),經(jīng)4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)表明兩組間有顯著性差異,P<0.01,表明LPS能明顯誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放大量炎性介質(zhì)NO。與LPS組相比,經(jīng)喜炎平或穿琥寧注射液作用的RAW264.7細(xì)胞上清液中,一氧化氮的含量明顯減少,隨著用藥濃度的增高NO的濃度逐漸降低,呈現(xiàn)出良好的劑量依賴關(guān)系。并且,喜炎平注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放一氧化氮的抑制作用明顯強(qiáng)于穿琥寧注射液,結(jié)果見(jiàn)圖2。2.3不同顯著性差異LPS組細(xì)胞上清液中IL-6的濃度遠(yuǎn)高于空白組,與空白組比較有顯著性差異。不同濃度的喜炎平或穿琥寧注射液可以明顯抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放IL-6,并呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系,喜炎平注射液對(duì)IL-6的抑制作用稍強(qiáng)于穿琥寧注射液,見(jiàn)表1。2.4喜炎平和穿表現(xiàn)對(duì)lps誘導(dǎo)的tnf-表達(dá)的影響經(jīng)1μg/ml的LPS刺激6h后,細(xì)胞釋放大量的TNF-α。不同濃度的喜炎平或穿琥寧注射液可以明顯抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α,并呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系,喜炎平注射液對(duì)TNF-α的抑制作用強(qiáng)于穿琥寧注射液,見(jiàn)表2。3喜炎平注射液治療低血清蛋白及相關(guān)炎性因子相關(guān)因素的作用機(jī)理脂多糖(LPS)是介導(dǎo)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合癥的主要啟因動(dòng)子。LPS本身并不造成機(jī)體的嚴(yán)重?fù)p害,它主要通過(guò)促使巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等釋放大量的細(xì)胞因子,直接激活的細(xì)胞因子有TNF-α、IL-6等,這些因子通過(guò)自分泌、旁分泌相互影響,使病變得以發(fā)展。巨噬細(xì)胞廣泛參與機(jī)體的炎癥反應(yīng),在正常情況下,靜止的巨噬細(xì)胞僅產(chǎn)生極少量的NO和TNF-α,當(dāng)巨噬細(xì)胞受異物、腫瘤、炎癥等激活后會(huì)產(chǎn)生大量的NO和TNF-α,并進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-6等炎性因子的產(chǎn)生。喜炎平注射液作為常用抗炎中藥制劑,在臨床上得以廣泛應(yīng)用,但其作用機(jī)理尚不十分清楚。范志霞等曾對(duì)穿琥寧體外抑制肺泡巨噬細(xì)胞過(guò)度釋放TNF-α的作用機(jī)理做了探討。本研究針對(duì)喜炎平注射液對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞釋放NO、IL