煙草接種cmv防治效果研究

香煙病毒在不同國(guó)家的植煙區(qū)都有危害，中國(guó)的大多數(shù)地區(qū)都容易發(fā)生。近年來(lái),云南省主要煙區(qū)病毒病的發(fā)生危害日趨嚴(yán)重,且有不斷上升的趨勢(shì),直接影響著云南省煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量,給云南省煙葉生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失,目前生產(chǎn)上用于防治煙草病毒病的藥劑比較單一,主要是植病靈Ⅰ號(hào)。為此,本試驗(yàn)通過(guò)人工接種CMV后,噴施植病靈Ⅰ號(hào)、病毒必克、LZ18-6,菌毒清、植病靈Ⅱ號(hào)、金葉寶和植物動(dòng)力2003進(jìn)行田間藥效及其抗性機(jī)理試驗(yàn)研究,以期篩選出1～2種最佳抗病毒劑應(yīng)用于大面積生產(chǎn)。對(duì)CMV的防治人們已作了大量的研究工作,王緯等研究得出多效肥對(duì)煙草黃瓜花葉病有積極的防治作用。有關(guān)研究表明,病毒侵染導(dǎo)致葉片光合作用時(shí)葉綠素和類胡蘿卜素的形成受到強(qiáng)烈抑制,煙草感染CMV后可明顯降低光合速率,并使呼吸強(qiáng)度上升,但對(duì)PAL活性、總酚和類黃酮有刺激作用。PAL是苯丙烷代謝的定速酶,與此代謝途徑有關(guān)的一些物質(zhì)與植物的抗病性有密切關(guān)系。木質(zhì)素可以加強(qiáng)細(xì)胞壁,增加木質(zhì)化程度,形成病原物入侵的機(jī)械屏障,而類黃酮物質(zhì)中的豌豆素、菜豆素則是重要的植保素,可以防止病原菌的再侵染。1材料和方法1.1供試地與培養(yǎng)試驗(yàn)于1998年在云南省煙草科學(xué)研究所試驗(yàn)基地病圃進(jìn)行,供試土壤為砂壤,肥力中等,前作苕子。2月23日播種,5月6日移栽。移栽行株距1.1m×0.65m,施肥及管理同優(yōu)質(zhì)煙栽培。1.2材料和來(lái)源1.2.1試驗(yàn)品種K326。1.2.2病毒的接種CMV。把分離提純的CMV在網(wǎng)室接種于黃瓜上擴(kuò)繁后,取新鮮病葉研磨成汁液,用磷酸緩沖液稀釋500倍待用。1.2.3植物、病毒藥及藥物①1.5%植病靈Ⅰ號(hào),600倍,云南星耀生物制品廠。②3.85%病毒必克,500倍,陜西海浪精細(xì)化工有限公司。③LZ18-6,200倍,長(zhǎng)沙市金葉天然植物開發(fā)有限公司。④5%菌毒清,250倍,云南牟定高新精細(xì)化工有限公司。⑤1.5%植病靈Ⅱ號(hào),300倍,山東省曲阜市爾福農(nóng)藥廠。⑥金葉寶,250倍,河南省長(zhǎng)葛市農(nóng)用生物廠。⑦植物動(dòng)力2003(PP2003),1000倍,植物動(dòng)力2003云南推廣中心。1.3測(cè)試方法1.3.1噴霧器接種前用藥次數(shù)用尼龍網(wǎng)覆蓋至移栽前培育無(wú)毒壯苗。移栽后22d(即5月28日)用工農(nóng)-16型噴霧器在接種前3d,接種后4d,11d按藥劑標(biāo)簽注明的使用方法各施藥1次,共施藥3次。1.3.2葉片噴槍接種施藥后3d(6月1日)用高壓噴槍接種CMV。病葉汁液稀釋液加入1%600目金剛砂,用高壓噴槍接種,噴射壓力1.5kg/cm2,噴嘴至接種葉片距離3～5cm,點(diǎn)射3次,每秒1次,接種后馬上噴清水至剛有液滴流下。1.3.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)設(shè)7個(gè)處理,1個(gè)對(duì)照,隨機(jī)排列,3次重復(fù),共24個(gè)小區(qū),每小區(qū)栽煙40株,共栽960株,試驗(yàn)面積666.7m2。1.3.4煙草病害分級(jí)及調(diào)查方法按小區(qū)在接種當(dāng)天調(diào)查病情基數(shù),發(fā)病情況在下次施藥當(dāng)天進(jìn)行,以后每7d調(diào)查一次,共調(diào)查5次。以株為單位分級(jí)調(diào)查,分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按《中華人民共和國(guó)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》“煙草病害分級(jí)及調(diào)查方法”進(jìn)行,編號(hào)為YC/T39-1996。計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果,計(jì)算方法如下:發(fā)病率(％)=發(fā)病株數(shù)調(diào)查總株數(shù)×100％(1)(％)=發(fā)病株數(shù)調(diào)查總株數(shù)×100％(1)病情指數(shù)=∑(各級(jí)病株×該病級(jí)值)調(diào)查總株數(shù)×4×100(2)=∑(各級(jí)病株×該病級(jí)值)調(diào)查總株數(shù)×4×100(2)相對(duì)防治效果(％)=對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)對(duì)照病情指數(shù)×100%(3)1.4葉綠素a及類黃酮活性測(cè)定在發(fā)病盛期(接種后40d)各處理按小區(qū)分別取病株和健株腰葉2片,即每處理病株、健株分別取6片葉,測(cè)定葉綠素a,葉綠素b,類胡蘿卜素、總酚和類黃酮含量以及苯丙氨酸酶(PAL)活性。1.4.1葉綠素及類胡蘿卜素含量測(cè)定每個(gè)樣品用打孔器(直徑0.5cm)取15小片放在25mL容量瓶中,用丙酮∶乙醇=1∶1的溶液定容,常溫下避光保存20h,用分光光度法測(cè)定,葉綠素a,葉綠素b,類胡蘿卜素含量以mg/dm2表示。1.4.2總酚含量測(cè)定用電子天平稱取0.5000g新鮮葉片剪至1～2mm的小塊,加1%HCl的甲醇溶液5mL提取24h(4℃),取0.5mL提取液用蒸餾水稀釋至25mL,測(cè)定OD280nm和OD325nm,類黃酮含量以O(shè)D325nm/g鮮重表示,總酚含量以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線加以計(jì)算。1.4.3l-苯丙氨酸氧基的制備取新鮮葉片0.5000g,加0.1000g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),1mL含0.5mmol巰基乙醇的硼酸緩沖液,4℃下研磨,10000r/min離心10min,取上清液0.1mL,加0.5mL0.02mol/L的L-苯丙氨酸,2.75mL重蒸水于30℃水浴中保溫30min,加入0.25mL5mol/LHCl終止反應(yīng),取200mL加5mL0.5mol/L巰基乙酸的硼酸緩沖液,測(cè)OD290nm,以O(shè)D變化為0.01為一個(gè)活性單位。2結(jié)果分析2.17金葉寶、pp2003對(duì)cmv的防治效果從表1可看出,接種1周后開始發(fā)病,2周后進(jìn)入發(fā)病高峰,以后病情逐漸上升;不同藥劑對(duì)CMV的防治效果差異明顯,金葉寶防效最好,第3次施藥當(dāng)天防效為54.38%,第3次施藥后9d防治持效仍達(dá)40.06%,其次是植病靈Ⅱ號(hào)和Ⅰ號(hào),第3次施藥后9d防效分別為28.96%和26.09%,PP2003對(duì)CMV無(wú)防治效果;從表1中還可看出除PP2003外,各種抗病毒劑的防治效果隨時(shí)間的推移逐漸下降。2.2對(duì)苯丙氨酸解氨酶活性的影響由表2和表3可看出以下5個(gè)方面:①?gòu)膶?duì)照看,煙株感染CMV后與健株相比葉綠素a和類胡蘿卜素、總酚和類黃酮含量、PAL活性上升趨勢(shì),而葉綠素b略有下降。②感染CMV煙株噴施植病靈Ⅰ號(hào)、病毒必克、LZ18-6,菌毒清、植病靈Ⅱ號(hào)、金葉寶后葉綠素a,b和類胡蘿卜素含量與對(duì)照相比明顯降低,噴施上述藥劑后病株與健株的比值在0.71～0.98之間,對(duì)照為0.90～1.06之間。③噴施金葉寶、植病靈Ⅱ號(hào)與其它處理相比,病株的總酚、類黃酮含量減少,病株與健株的比值在0.93～0.99之間,與其它處理及對(duì)照相比,表現(xiàn)為病株所測(cè)各項(xiàng)生理指標(biāo)保持或接近正常煙株的所測(cè)各項(xiàng)生理指標(biāo);噴施植病靈Ⅰ號(hào)、病毒必克、LZ18-6,菌毒清的處理病株總酚、類黃酮含量上升,病株與健株的比值均大于1.00,在1.03～1.66之間。④各處理苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性明顯上升(噴施1.5%植病靈Ⅱ號(hào)處理除外),由此推測(cè)PAL的活性可能與煙株本身對(duì)CMV的抗性有關(guān)。⑤噴施PP2003煙株總酚、類黃酮、葉綠素a,葉綠素b,類胡蘿卜素含量及苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性與對(duì)照相近,這與上述PP2003對(duì)CMV無(wú)防治效果是一致的。3對(duì)cmv的防治效果(1)本研究結(jié)果表明煙株感染CMV后葉綠素a,葉綠素b,類胡蘿卜素、總酚、類黃酮含量及PAL活性增高,葉綠素b含量下降;施藥后病株的葉綠素a,葉綠素b,類胡蘿卜素含量下降,防治效果較好的藥劑,即金葉寶和植病靈Ⅱ號(hào)噴施后感染CMV煙株的總酚、類黃酮、PAL活性、葉綠素a,葉綠素b,類胡蘿卜素含量保持或接近正常煙株的含量,說(shuō)明兩種藥劑都能有效地抑制CMV對(duì)煙株的再侵染,這與兩種藥劑防治效果最好是一致的。(2)各處理接種CMV后均不同程度發(fā)病,說(shuō)明上述7種藥劑在接種前3d噴施均不能完全抑制CMV的感染。發(fā)病初期噴施LZ18-6,菌毒清和金葉寶能有效控制病情;植病靈Ⅰ號(hào)和植病靈Ⅱ號(hào)的藥效緩慢但持久,在停藥后10d仍能有效地控制CMV危害的進(jìn)一步加重;菌毒清、LZ18-6兩種藥劑在施藥期間防效也較好,但停施后防效下降快,說(shuō)明宜連續(xù)施藥方可達(dá)到理想的效果。(3)PP2