應(yīng)用比較基因組雜交技術(shù)分析乳腺乳頭狀腫瘤不同類型染色體基因組dna的變化

乳腺癌和腫瘤是罕見的乳腺癌，近年來發(fā)病率逐漸升高。2003年WHO新分類中將其分為良性、交界性、惡性3種,其不同的病理類型反應(yīng)了該瘤由良性發(fā)展為惡性的過程。我們應(yīng)用比較基因組雜交(comparativegenomichybridization,CGH)技術(shù)分析乳腺葉狀腫瘤不同類型染色體基因組DNA拷貝數(shù)的變化,初步探索該腫瘤的分子細(xì)胞遺傳學(xué)變化,為進(jìn)一步從全基因組染色體角度研究該瘤的惡變機(jī)制提供較有價(jià)值的資料。一、內(nèi)鏡標(biāo)本檢測(cè)1.病例選擇與標(biāo)本處理:9例乳腺葉狀腫瘤抽取自天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺病理研究室2001～2004年存檔標(biāo)本,經(jīng)2名主任醫(yī)師依據(jù)2003年WHO分類復(fù)習(xí)原HE切片并確診,其中良性、交界性、惡性各3例。2.石蠟包埋組織基因組DNA的提取:以HE切片作為參照,選取組織蠟塊中腫瘤間葉組織(腫瘤細(xì)胞占到90%以上),10μm厚切片,使用EZNA組織DNA提取試劑盒(美國OmegaBio-tek公司)提取基因組DNA,提取過程按照試劑盒說明書進(jìn)行。3.中期染色體標(biāo)本的制備:按常規(guī)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室中期染色體標(biāo)本的制備程序進(jìn)行。將制備好的正常男性或女性外周血標(biāo)本在室溫下放置1周,標(biāo)本檢測(cè)質(zhì)量合格者用于CGH。55℃烤箱烤片5～7h,于-20℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?.通過缺口平移進(jìn)行DNA標(biāo)記:BIONICKTM標(biāo)記系統(tǒng)(Invitrogen公司)標(biāo)記腫瘤組織的基因組DNA,地高辛-11-dUTP(1nmol/μl,羅氏診斷公司)與NickTranslation系統(tǒng)(Invitrogen公司)標(biāo)記正常組織基因組DNA。具體標(biāo)記過程按照相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行。5.CGH探針的制備:在1.5mlEppendorf管中依次加入標(biāo)記好的腫瘤DNA和正常DNA各200ng、人Cot-1DNA30μl、3mmol/L乙酸鈉5μl、2.5倍體積的冰乙醇約160μl,-80℃低溫冰箱中2h;4℃14000r/min離心30min;輕輕倒掉乙醇,室溫風(fēng)干20～30min;將探針溶于雜交液中混勻。6.中期染色體片雜交前的預(yù)處理:(1)RNaseA預(yù)處理:每片染色體片加稀釋的RNaseA100μl,37℃1～1.5h;室溫下2×SSC洗滌5min,梯度乙醇脫水,室溫干燥。(2)胃蛋白酶處理:將上述中期染色體片放入37℃2×SSC中20min;37℃新鮮配制的0.01mol/LHCl/pepsin溶液中10min;梯度乙醇脫水;室溫干燥。7.變性和雜交:將玻片標(biāo)本變性液在75℃水浴中預(yù)溫至(73±2)℃;處理好的染色體片置變性液中1min;在乙醇系列中脫水;室溫風(fēng)干;同時(shí)將CGH探針在75℃水浴中變性10min;在恒溫板上將CGH探針加到事先標(biāo)記好的區(qū)域上,37℃濕盒中雜交3d。8.雜交后洗脫;使用生物素/地高辛雙色標(biāo)記檢測(cè)試劑盒(北京諾賽基因組研究中心有限公司),按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。9.顯微照相和圖像分析;在數(shù)字化染色體分析工作站進(jìn)行。染色體獲得、擴(kuò)增和丟失的判定標(biāo)準(zhǔn)分別為實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得曲線>1.25、>1.5和<0.75(圖1)。二、乳腺癌組織學(xué)檢測(cè)1.9例乳腺葉狀腫瘤CGH分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù):在良性、交界性和惡性乳腺葉狀腫瘤中,染色體的變化平均分別為8、19和25個(gè)區(qū)域。如例1為良性葉狀腫瘤(圖1),在5q14-15,6q13-14.1處有獲得,在1p36.13-36.3,9q34處有丟失,無擴(kuò)增區(qū);例6為交界性葉狀腫瘤,在1p21.1-q21等處有獲得,在1q44等處有丟失,無擴(kuò)增區(qū)。2.染色體共同丟失、獲得和擴(kuò)增情況:乳腺良性葉狀腫瘤的共同染色體丟失區(qū)為9q34(2/3)。乳腺交界性葉狀腫瘤在4p12、9q21.11、13q12.1、14q11.2處有共同獲得(2/3),在8q24.2、9q34、12q24.3、16q23.2-24、20q13.3、21q22.2-22.3、22q13、15q26.1-26.2處有共同丟失(2/3);3例均在1q21,4q12處有獲得,在17q25.1-25.2和19q13.2-13.4處有丟失;僅1例出現(xiàn)9p12.13和14p11.2處的擴(kuò)增。乳腺惡性葉狀腫瘤在3p12-13、4p12-q13.1、5p13.1-q11.2、6q12-13、7p12.1-21.1、8q11.2、8q12.1、9p12、9p21.1、9q12、10q11.21、14q11.2-12、15q11.2-13、16p11.2-11.6、16q12.1-13、18p11.2、19q13.1、Xp11.3處有共同獲得(2/3);在2q37.2、9q34.1、12q24.22-24.32、17q25.2、20q13.1、20q13.3、22q13.2-13.3處有共同丟失(2/3);在1p12-13.2和15q11.2處有共同擴(kuò)增(2/3),3例都有1p12-13、11p11.2、18p11.2處的獲得。全部病例1q處的獲得最常見(7/9),其次是1p、9q處的獲得(6/9),丟失區(qū)最常發(fā)生在9q、17q(6/9),3p處未見染色體丟失。三、內(nèi)鏡內(nèi)鏡研究CGH技術(shù)可以了解全基因組各染色體區(qū)段的擴(kuò)增或缺失,用少量的DNA就可以檢測(cè)到腫瘤惡變過程不同階段、腫瘤不同進(jìn)展時(shí)期以及不同類型腫瘤細(xì)胞整個(gè)基因組水平的非隨機(jī)性染色體DNA拷貝數(shù)的改變。因此CGH技術(shù)特別適用于顯示腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中癌前病變、浸潤性癌、轉(zhuǎn)移癌等染色體基因組的改變,從而顯示在癌變?cè)缙谄鹗茧A段、腫瘤進(jìn)展或轉(zhuǎn)移階段起作用的原癌基因或腫瘤抑制基因的定位。目前,有關(guān)CGH的文獻(xiàn)90%以上是涉及腫瘤研究。國外僅檢索到2篇將CGH技術(shù)用于乳腺葉狀腫瘤的研究;國內(nèi)則多為綜述類文章。對(duì)于已發(fā)表的2篇國外文獻(xiàn),其研究結(jié)論不一致。其中1997年Lu等應(yīng)用CGH技術(shù)研究了18例患者的19份樣本,結(jié)果發(fā)現(xiàn)1q處的獲得(7/18)和3p處的丟失(6/18)最常見,1q處的獲得與腫瘤間質(zhì)過度生長(zhǎng)有關(guān),而且1q處的獲得與腫瘤復(fù)發(fā)有相關(guān)性,于是認(rèn)為其可能是局部侵襲性的一個(gè)標(biāo)志,對(duì)有1q處獲得的病例應(yīng)給予更為積極的治療。而2003年Jee等對(duì)22例乳腺葉狀腫瘤應(yīng)用CGH技術(shù)研究DNA拷貝數(shù)的變化,應(yīng)用雜合子丟失(LOH)技術(shù)研究3p處的等位失衡,發(fā)現(xiàn)1q處的獲得是該瘤常見的異常,DNA拷貝數(shù)的變化與葉狀腫瘤的組織學(xué)分級(jí)和臨床行為無相關(guān)性,3p處的染色體改變罕見。