遷移實驗（cellmigrationassay）實驗介紹

細胞遷移與侵襲實驗將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，將研究的細胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細胞，應用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養(yǎng)、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。

實驗步驟：

1材料準備：

可拍照顯微鏡，Transwell小室，孔徑8μm，沒包被膠的(Coster和Corning公司的也較常用)，Transwell遷移實驗的細胞培養(yǎng)板24孔板。細胞培養(yǎng)板應當與購買的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，無血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培養(yǎng)基，DMEM完全培養(yǎng)基，1640完全培養(yǎng)基（也可加到20%血清），無菌PBS，棉簽，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，結晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS結晶紫）

2步驟和流程

2.1基質(zhì)膠鋪板：

用BD公司的Matrigel1：8（根據(jù)細胞產(chǎn)生mmp的量來決定）稀釋，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進行基底膜水化。

2.2制備細胞懸液

①制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓12－24h，進一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。

②消化細胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細胞密度至5×105/ml。

2.3接種細胞

①取細胞懸液100μl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培養(yǎng)基，特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養(yǎng)板。

③培養(yǎng)細胞：常規(guī)培養(yǎng)12－48h（主要依癌細胞侵襲能力而定）。24h較常見，時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外，處理因素對細胞數(shù)目的影響也不可忽視。

2.4結果統(tǒng)計

直接計數(shù)法，“貼壁”細胞計數(shù)，這里所謂的“貼壁”是指細胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側而不會掉到下室里面去，通過給細胞染色，可在鏡下計數(shù)細胞。

取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，甲醇固定30分鐘，將小室適當風干。

0.1%結晶紫染色20min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，用PBS洗3遍。

400倍顯微鏡下隨即五個視野觀察細胞，記數(shù)。實驗材料（1）Transwellchamber:24-well,8.0-μmporemembranes(Corning)（2）細胞培養(yǎng)相關試劑：無血清培養(yǎng)基，10％血清培養(yǎng)基，PBS，0.02％EDTA（3）固定液：甲醇（4）染色液：Giemsa染液（5）封片劑：中性樹膠（6）其他：小鑷子，棉棒，載玻片，蓋玻片操作步驟（1）所有細胞培養(yǎng)試劑和Transwellchamber放在37℃溫育；（2）待測細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化細胞，用PBS和無血清培養(yǎng)基先后洗滌一次，用無血清培養(yǎng)基懸浮細胞，計數(shù)，調(diào)整濃度為2×105/ml；（3）在下室（即24孔板底部）加入600－800μl含10％血清的培養(yǎng)基，上室加入100－150μl細胞懸液，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24小時；（4）用鑷子小心取出chamber，吸干上室液體，移到預先加入約800μl甲醇的孔中，室溫固定30分鐘；（5）取出chamber，吸干上室固定液，移到預先加入約800μlGiemsa染液的孔中，室溫染色15－30分鐘；（6）輕輕用清水沖洗浸泡數(shù)次，取出chamber，吸去上室液體，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細胞；（7）用小鑷子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至載玻片上用中性樹膠封片；（8）顯微鏡下取9個隨機視野計數(shù)，統(tǒng)計結果。注意事項（1）根據(jù)待測細胞體積大小選擇合適孔徑的chamber。常用的為8.0-μm孔徑（如AGS細胞），如果細胞體積較大可以考慮用10-μm孔徑；（2）根據(jù)待測細胞的遷移能力強弱調(diào)整細胞數(shù)和遷移時間。常規(guī)24-wellchamber接種細胞數(shù)約為2≈5×104/well，遷移時間12≈36小時；（3）由于Corning公司的24-Transwell內(nèi)含12個獨立的chamber，為了避免操作污染，每次實驗可預先另準備一塊24孔普通培養(yǎng)板（Corning）；（4）如果細胞遷移能力較弱，下室液體可用3T3細胞無血清培養(yǎng)24小時獲得的上清加50μg/mlFN（Fibronectin），具體可查閱相關文獻；（5）細胞懸液加入膜中央，盡量保證液面水平；（6）固定染色擦洗時動作小心，避免擦去膜底面的細胞。但一定要充分擦凈膜表面上未遷移的細胞，以免影響讀數(shù)。尤其是膜周邊上可用細牙簽或小鑷子纏上濕棉花擦洗，但要小心避免將膜戳破；（7）Chamber和膜上都無法標記，操作時應小心避免混淆實驗組和對照組；（8）充分晾干，避免殘留水分導致鏡下聚焦不一致。細胞侵襲實驗（cellinvasionassay）實驗材料（1）Matrigel(BD5mg/ml)，-20℃保存（2）其余材料同遷移實驗操作步驟（1）Matrigel在4℃過夜融化；（2）用4℃預冷的無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至終濃度1mg/ml，冰上操作；（3）在chamber上室底部中央垂直加入100μl稀釋后的Matrigel，37℃溫育4－5小時使其干成膠狀；（4）后續(xù)步驟同遷移實驗（1-8）。注意事項（1）Matrigel在過高或過低的溫度均易凝固，因此操作所需槍頭和離心管應提前在4℃預冷；（2）鋪膠時保證液面水平，膠的厚度均勻一致，切勿產(chǎn)生氣泡；（3）其他注意事項同遷移試驗。其他Transwell做腫瘤侵襲實驗的具體步驟(1)基質(zhì)膠準備：將凍存于－80度冰箱的BDmatrigel4度過夜（24h），變成液態(tài)；

（2）取300ul無血清培養(yǎng)基，加入60ul（或50ug/每室）Matrigel，混勻，（4℃操作，最好在冰浴上），加入上室各100ul（3個室）；放入37℃培養(yǎng)箱中，孵育4-5h（>5h）；此間經(jīng)常觀察，當出現(xiàn)“白色層”時，說明已經(jīng)變?yōu)楣虘B(tài)。

注釋：無血清培養(yǎng)基和基質(zhì)膠按1：5稀釋，每孔加50ul，在37℃培養(yǎng)箱中1-2h。

（3）消化細胞，無血清培養(yǎng)基洗3次，計數(shù)，配成細胞懸液；

（4）用無血清培養(yǎng)基洗Matrigel洗1次；每孔加入100ul細胞懸液；

（5）下腔室中加入500ul含有20％FBS條件培養(yǎng)基；

（6）37℃培養(yǎng)箱中，孵育20-24h；

（7）取出transwell用PBS洗2遍，5%戊二醛固定，4℃；

（8）加入結晶紫（0.1%）染色或Giemsa染色（5－10min），室溫0.5h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面細胞，顯微鏡下觀察。遷移實驗

transwell在24孔板中浸泡1小時；消化細胞，無血清培養(yǎng)基洗2次，計數(shù)，配成細胞懸液，每孔加入100ul細胞懸液；加藥刺激；下腔室中加入條件培養(yǎng)基或其他刺激因子；37℃培養(yǎng)箱中，孵育20-24h；取出transwell用PBS洗2遍，5%戊二醛固定，4℃；PBS洗2遍，加入結晶紫（0.1%）染色，室溫0.5h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面細胞，顯微鏡下觀察計數(shù)10照相，記錄。

侵襲實驗

取300ul無血清培養(yǎng)基，加入30ul（或50ug/每室）Matrigel，混勻，（4℃操作，最好在冰浴上），加入上室各100ul（3個室）；放入37℃培養(yǎng)箱中，孵育4-5h（>5h）；消化細胞，無血清培養(yǎng)基洗3次，計數(shù)，配成細胞懸液；用無血清培養(yǎng)基洗Matrigel洗1次；每孔加入100ul細胞懸液；下腔室中加入600ul無血清條件培養(yǎng)基；37℃培養(yǎng)箱中，孵育20-24h；取出transwell用PBS洗2遍，5%戊二醛固定，4℃；PBS洗2遍，加入結晶紫（0.1%）染色，室溫0.5h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面細胞，顯微鏡下觀察transwell小室是否可以重復利用，該怎樣消毒用棉簽輕輕擦去膠和反面細胞，清水沖洗，超聲清洗，低擋，30min，清水3×5min，蒸餾水3×5min，室溫涼干，用前紫外線小室正面3h，反面6h，微波，低火10min×2，效果很好。第一章人體的內(nèi)環(huán)境與穩(wěn)態(tài)第一節(jié)細胞生活的環(huán)境一、教學內(nèi)容及內(nèi)容分析《細胞生活的環(huán)境》是必修三第一章《人體的內(nèi)環(huán)境與穩(wěn)態(tài)》的第1節(jié)內(nèi)容，包括細胞生活在細胞外液中、細胞外液的成分、細胞外液的滲透壓與酸堿度、內(nèi)環(huán)境是細胞與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換的媒介等四部分內(nèi)容。該節(jié)內(nèi)容是第二節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要性的基礎，也為第二章《動物和人體生命活動的調(diào)節(jié)》的的講解做好了鋪墊。本節(jié)內(nèi)容涉及的概念、原理和生理過程較多，而且抽象、復雜。如體液、內(nèi)環(huán)境、內(nèi)環(huán)境的組成、細胞外液的滲透壓、酸堿度等概念都非常抽象，難以理解。為了幫助學生學好知識，提高學習興趣，在本節(jié)的課堂教學中，采用了“圖表教學法”，充分利用教材插圖、設計歸納圖、多媒體圖像等手段，使抽象的概念具體化便于學生理解。在教學過程中，以多媒體計算機輔助教學，充分利用各種信息技術資源來支持學生的學習，開展師生互動。二、學生情況分析高二年級的學生認知特點鮮明，思維活躍，邏輯思維能力有了一定發(fā)展。在學習過程中，他們自主學習能力提高，學習策略和技巧更加完善，更關注與生產(chǎn)實踐和社會生活密切相關的內(nèi)容；通過前面的學習，學生已了解了組成細胞的分子、細胞的基本結構和細胞的物質(zhì)輸入和輸出等內(nèi)容，為本節(jié)課的學習打下基礎。如果學習時間跨度大，很多知識可能已經(jīng)淡忘，應在教學過程中多提示多引導。很多內(nèi)容比較抽象，不易理解，在學習上具有一定的難度，需適時使用多媒體課件，使抽象的內(nèi)容變得直觀生動，便于學生領會。三、教學目標及目標解析

1、教學目標（1）知識與技能①．描述內(nèi)環(huán)境的組成和理化性質(zhì)。②．說明內(nèi)環(huán)境是細胞與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換的媒介。③．說明內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的意義（2）過程與方法：嘗試建構人體細胞與外界環(huán)境的物質(zhì)交換模型。（3）情感和態(tài)度價值觀通過內(nèi)環(huán)境組成間關系的分析建立事物間區(qū)別與聯(lián)系的觀點2、教學重點（1）．內(nèi)環(huán)境的組成和理化性質(zhì)。（2）．內(nèi)環(huán)境是細胞與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換的媒介。3、教學難點（1）．內(nèi)環(huán)境的組成和理化性質(zhì)。（2）．內(nèi)環(huán)境是細胞與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換的媒介。4、目標分析（1）．描述內(nèi)環(huán)境的組成和理化性質(zhì)。（2）．說明內(nèi)環(huán)境是細胞與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換的媒介。（3）．嘗試建構人體細胞與外界環(huán)境的物質(zhì)交換模型。(4)．嘗試建構人體細胞與外界環(huán)境的物質(zhì)交換模型(5)．認同內(nèi)環(huán)境是細胞生活的環(huán)境

四、教學問題診斷：針對本節(jié)課的教學目標和重點、難點，在教學過程中應注意以下一些內(nèi)容：本節(jié)課是本章第一節(jié)也是本書第一節(jié)，所以引言顯得至關重要，應聯(lián)系實際，從學生的生活出發(fā)，激發(fā)學生的學習興趣，讓學生很快地進入課堂，參與到課堂。體液的概念是學生容易出錯的地方，所以在這里應及時舉一些例子讓學生判斷。三種細胞外液學生很容易理解和體會，但關鍵是讓他們知道三者之間的轉換關系，可以先讓學生看書，然后畫出關系圖，教師也可以用圖來表示。細胞外液的化學成分主要了解血漿的化學成分，“討論”中的題可以有選擇的討論，不必一一討論，因為學生的知識是漸進的，可以放后面討論。細胞外液的三個理化性質(zhì)中滲透壓的概念難理解，所以花較多時間，可以與以前學過的細胞失水和吸水想聯(lián)系，并與生活聯(lián)系，即生理鹽水。其他兩個性質(zhì)可以花少量時間，并結合血漿的化學成分以及化學知識進行講解。最后內(nèi)環(huán)境作為細胞與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換的媒介的知識要注意讓學生分析，可以結合書本的“思考與討論”，分析幾種成分是如何進入內(nèi)環(huán)境以及一些代謝廢物是如何運出體外的，這部分內(nèi)容學生在初中已經(jīng)有所接觸，所以學生較容易理解。最后應該對本課知識進行回顧總結，強調(diào)重難點，以及布置適當?shù)恼n后練習讓學生對知識及時鞏固。五、教具準備：教科書、課程標準、教案、幻燈片、音響媒體六、教學方法與手段1教學方法：問題驅動法，小組合作法2.教學手段：問題式教學，合作式教學七、教學流程課題必修三1.1細胞生活的環(huán)境課時1流程教師活動學生活動媒體、方法設計意圖新章節(jié)導入新授：一、體內(nèi)細胞生活在細胞外液中二、細胞外液的成分三、細胞外液的滲透壓和酸堿度四、內(nèi)環(huán)境是細胞與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換的媒介課堂小結學生精練學生精練作業(yè)布置出示圖片：1、“黑河好八連在哨位站崗”；2、“煉鋼廠煉鋼爐前工人工作”學生思考他們的體溫會變化嗎？出示教學目標出示圖片：草履蟲，多媒體顯示問題：討論1：我們看到的是什么細胞？討論2：它生活在什么樣的環(huán)境中？它與生活環(huán)境有和關系？總結：單細胞生物（如草履蟲）直接生活在外界環(huán)境中，可直接與外界進行物質(zhì)交換。多細胞生物的細胞（如血細胞）生活在體內(nèi)的液體環(huán)境中。下面我們重點探討人體內(nèi)的細胞。多媒體顯示：【自主探究一】閱讀思考：閱讀教材P2-3關于“體內(nèi)細胞生活在細胞外液中”這一部分內(nèi)容，思考：1、體液、細胞內(nèi)液、細胞外液、內(nèi)環(huán)境的概念并填寫導學案2、用適當?shù)姆绞奖硎境鼋M織液、血漿、淋巴和組織細胞之間的相互關系。多媒體出示知識點：：1、體液定義體液的組成2、補充細胞內(nèi)液的組成找學生上黑板書寫組織液、血漿、淋巴和組織細胞之間的相互關系。出示正確圖示并讓學生與自己書寫的進行對比【合作探究】細胞外液主要包括血漿、組織液、淋巴液等。我們觀看下面一段動畫，體內(nèi)細胞與內(nèi)環(huán)境之間物質(zhì)交換的視頻（多媒體顯示）出示靜態(tài)圖：并提問血細胞直接生活的環(huán)境是什么？淋巴細胞直接生活的環(huán)境是什么？組織細胞直接生活的環(huán)境是什么？出示習題連連看【提問】內(nèi)環(huán)境的概念是什么？多媒體出示內(nèi)環(huán)境的概念內(nèi)涵：1、內(nèi)環(huán)境與細胞外液是同一概念。內(nèi)環(huán)境是相對于外界環(huán)境提出，細胞外液是相對于動物和人的細胞內(nèi)液提出的。2、主要包括組織液、血漿和淋巴，但不是說就只有這三種。例如，腦脊液也屬于內(nèi)環(huán)境組成成分。3、人的呼吸道、肺泡腔、消化道等屬于人體與外界相通的環(huán)境，因而汗液、尿液、消化液、淚液等液體不屬于內(nèi)環(huán)境的組成。[過渡]那么內(nèi)環(huán)境與外界環(huán)境有哪些差別呢？細胞外液有哪些化學成分呢？【自主探究二】資料分析血漿的化學組成。并做P4討論題【總結】多媒體顯示：細胞外液的成分（以血漿為例）【自主探究三】閱讀P5“細胞外液的滲透壓和酸堿度”這一部分內(nèi)容并填寫導學案相關內(nèi)容并回答問題：血漿的滲透壓大小主要與什么物質(zhì)的含量有關？3、細胞外液的滲透壓主要來自那些物質(zhì)？2、.HCO-3—、HPO2-4—可能起什么作用？【總結】。1、滲透壓概念：指溶液中溶質(zhì)微粒對水的吸引力。大?。喝Q于溶液中溶質(zhì)微粒的數(shù)目。溶質(zhì)微粒越多，即溶液濃度越高，對水的吸引力越大，即溶液滲透壓越高。反之亦然。血漿滲透壓：大小主要與無機鹽、蛋白質(zhì)的含量有關。人的血漿滲透壓約為770kPa，相當于細胞內(nèi)液的滲透壓。2、酸堿度—血漿的pH7.35~7.45。血漿的pH之所以能夠保持穩(wěn)定，與它含有HCO-3、HPO2-4等離子有關3、溫度——人體細胞外液溫度一般維持在37℃左右。滲透壓，酸堿度，溫度是內(nèi)環(huán)境的三種理化性質(zhì)【總結】：多媒體顯示1、細胞作為一個開放的系統(tǒng)，可以直接與內(nèi)環(huán)境進行物質(zhì)交換2、內(nèi)環(huán)境作為細胞與外界環(huán)境間的媒介，與體內(nèi)各系統(tǒng)間發(fā)生密不可分的功能聯(lián)系?！境鍪尽績?nèi)環(huán)境與外界環(huán)境物質(zhì)交換圖示模型【小結】圖片出示。綜合知識，本節(jié)小結：通過本節(jié)課的學習，我們要學習了體液、細胞內(nèi)液、細胞外液、內(nèi)環(huán)境的概念，內(nèi)環(huán)境中三者之間的關系，細胞外液的成分，細胞外液的理化性質(zhì)，以及外界物質(zhì)如何與外界環(huán)境發(fā)生物質(zhì)交換。著重要掌握體液、細胞內(nèi)液、細胞外液、內(nèi)環(huán)境的概念，內(nèi)環(huán)境中三者之間的關系，外界物質(zhì)如何與外界環(huán)境發(fā)生物質(zhì)交換。投影完整板書。1、下列選項，哪些屬于外界環(huán)境？哪些屬于細胞內(nèi)液？哪些屬于內(nèi)環(huán)境？A．空氣B．核液C．線粒體基質(zhì)D．土壤E．組織液F．淋巴G．腦脊液H．細胞質(zhì)基質(zhì)I．尿液J．消化道(從口腔至肛門)K．呼吸道(氣管→支氣管→肺泡腔)L．口腔M．血漿(1)屬于外界環(huán)境的有(2)屬于細胞內(nèi)液的有(3)屬于內(nèi)環(huán)境的有2、．人體的內(nèi)環(huán)境是指A．體液 B．細胞內(nèi)液 C．細胞外液 D．血液 2.對內(nèi)環(huán)境的論述正確的是A、內(nèi)環(huán)境指的是人體內(nèi)的體液B、內(nèi)環(huán)境指的是細胞外液C、內(nèi)環(huán)境指的是細胞內(nèi)液D、內(nèi)環(huán)境指的是組織液血液和淋巴3．血漿中水的來源是A．組織液B．消化道、組織液、淋巴C．淋巴和組織液D．消化道和組織液 4．下列對血漿、組織液和淋巴的敘述錯誤的是A．血漿成分滲出毛細血管就成為組織液B．淋巴滲出毛細淋巴管就成為組織液 C．組織液滲入毛細血管就成為血漿 D．組織液滲入毛細淋巴管就成為淋巴 5．在下列物質(zhì)中，不是人體內(nèi)環(huán)境組成成分的是A．血紅蛋白 B．葡萄糖C．二氧化碳和氧 D．氨基酸7．紅細胞、肌細胞，和淋巴細胞所處的內(nèi)環(huán)境依次是：A．血漿、體液和體液

B．血液、體液和淋巴 C．血漿、組織液和淋巴 D．血液、細胞外液和體液 8．可以直接與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換的生物是A．家兔 B．魚類 C．鳥類 D．草履蟲 9．體液是動物及人體內(nèi)含有的液體，它包括=1\*GB3①細胞內(nèi)液=2\*GB3②血漿=3\*GB3③淋巴=4\*GB3④組織液=5\*GB3⑤消化液A．=1\*GB3①=3\*GB3③=5\*GB3⑤ B．=1\*GB3①=2\*GB3②=3\*GB3③ C．=2\*GB3②=3\*GB3③=4\*GB3④ D．=1\*GB3①=2\*GB3②=3\*GB3③=4\*GB3④10．下列說法正確的是A．血漿是血細胞直接生活的環(huán)境 B．在人體的體液中，細胞內(nèi)液約占1／3，細胞外液約占2／3 C．組織液是體內(nèi)所有細胞直接生活的環(huán)境 D．淋巴和組織液中含有較多的蛋白質(zhì)，而血漿中蛋白質(zhì)較少 11．關于滲透壓的說法不正確的是：A．溶液滲透壓的大小取決于單位體積溶液中溶質(zhì)微粒體積，而與溶質(zhì)微粒數(shù)目關系不大 B．血漿滲透壓大小主要與無機鹽、蛋白質(zhì)含量有關 C．細胞外液滲透壓90%以上來源于Na+和Cl- D．在37℃時，人的血漿滲透壓約為770kPa，相當于細胞內(nèi)液的滲透壓12．下列關于內(nèi)環(huán)境的敘述中，不正確的是A．內(nèi)環(huán)境是細胞賴以生存的液體環(huán)境B．內(nèi)環(huán)境是細胞內(nèi)的環(huán)境，即細胞內(nèi)液．C．高等動物體內(nèi)細胞一般要通過內(nèi)環(huán)境才能與外界進行物質(zhì)交換 D．內(nèi)環(huán)境主要由血漿、組織液、淋巴構成 13．下圖是人體內(nèi)環(huán)境示意圖。若某人長期營養(yǎng)不良，血漿蛋白質(zhì)降低，首先會引起圖中哪一部分的液體增多？A．AB．BC．CD．3教材P61、技能訓練：構建人體細胞與外界環(huán)境的物質(zhì)交換模型2、課后練習題思考并回答問題（不會，因為人是恒溫的）觀看并思考后