細(xì)胞間粘附分子1Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白的表達(dá)、分離與純化的開題報(bào)告一、研究背景細(xì)胞間粘附分子（intercellularadhesionmolecule，ICAM）是一組膜蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞間黏附的調(diào)控，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞診斷、治療等領(lǐng)域。ICAM分子包括ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3，其中ICAM-1是由于其在炎癥過程中的重要性而最為廣泛地研究和應(yīng)用。ICAM-1在炎癥反應(yīng)中參與免疫細(xì)胞與上皮細(xì)胞的黏附和遷移，受到多種外界刺激的調(diào)節(jié)。因此，ICAM-1是一種非常重要的研究對(duì)象?，F(xiàn)有的研究已經(jīng)表明，ICAM-1的功能區(qū)分為N端、D1、D2和膜區(qū)，不同功能區(qū)分別與免疫細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)等分子發(fā)生作用。因此，對(duì)ICAM-1功能區(qū)蛋白的表達(dá)、分離與純化是進(jìn)行其研究的基礎(chǔ)。但是，迄今為止，ICAM-1的表達(dá)、分離與純化還不夠完善。因此，本研究將對(duì)細(xì)胞間粘附分子1Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白的表達(dá)、分離和純化方法進(jìn)行探究和優(yōu)化，以期能夠得到高效且純度較高的目標(biāo)蛋白質(zhì)。二、研究?jī)?nèi)容和方法1.表達(dá)ICAM-1功能區(qū)蛋白的重組質(zhì)粒的構(gòu)建采用RT-PCR技術(shù)從人體靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中獲取ICAM-1的cDNA序列，設(shè)計(jì)適合亞克隆到重組質(zhì)粒中的引物，利用接頭PCR擴(kuò)增ICAM-1功能區(qū)的編碼序列，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入攜帶His-Tag的基因表達(dá)載體中，構(gòu)建表達(dá)ICAM-1功能區(qū)蛋白的重組質(zhì)粒。2.細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和蛋白的表達(dá)利用文獻(xiàn)報(bào)道的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中，通過Westernblotting和間接免疫熒光共聚焦顯微鏡檢測(cè)ICAM-1功能區(qū)蛋白的表達(dá)情況。優(yōu)化合適的細(xì)胞培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)時(shí)間，提高蛋白表達(dá)的效率。3.蛋白的分離和純化分別采用尿素-SDS凝膠和酰胺-SDS凝膠對(duì)過表達(dá)的ICAM-1功能區(qū)蛋白進(jìn)行分離，優(yōu)選酰胺-SDS凝膠對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行分離。對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行不同濃度尿素溶液或甲醇/乙醇添加物處理的方法進(jìn)行去鹽、去內(nèi)源性蛋白和去異物蛋白，以及純化方法的優(yōu)化，使用親和層析柱以保障蛋白純度。三、研究意義和預(yù)期結(jié)果本研究將對(duì)ICAM-1功能區(qū)蛋白的表達(dá)、分離與純化方法進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得較高純度的蛋白質(zhì)，有望在研究ICAM-1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能與調(diào)控機(jī)制等方面提供一個(gè)有效的工具。同時(shí)，也為ICAM-1蛋白質(zhì)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。預(yù)期結(jié)果：1.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒并實(shí)現(xiàn)了ICAM-1功能區(qū)的表達(dá)。2.針對(duì)ICAM-1功能區(qū)蛋白的分離實(shí)驗(yàn)，分離純得較高的蛋白樣品，并優(yōu)化分離方法。3.成功應(yīng)用親和層析柱純化ICAM-1功能區(qū)蛋白和比較不同純化方案的差異。4.獲得高效純凈的ICAM-1功能區(qū)蛋白樣品，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。四、研究進(jìn)展和難點(diǎn)1.已利用RT-PCR技術(shù)成功擴(kuò)增出ICAM-1功能區(qū)的編碼序列。2.已成功構(gòu)建ICAM-1功能區(qū)蛋白的表達(dá)載體，過表達(dá)的蛋白樣品取得的