異體樹突狀細胞聯(lián)合細胞因子誘導的殺傷細胞治療微小殘留白血病的臨床研究

近年來，細胞免疫治療已成為癌癥治療的熱點。由細胞因子（cytokineinducedcik）引起的損傷細胞具有高效抗血小板聚集細胞的作用，用于急性采血和淋巴瘤的治療。樹突狀細胞(dendriticcell,DC)作為一種高效抗原提呈細胞,與CIK細胞聯(lián)用可誘導CIK細胞特異性應答、提高CIK細胞對靶細胞的殺傷效應,較單純CIK細胞更為完善?，F(xiàn)今急性白血病的緩解率已達50%~90%,但多數(shù)患者(除陽性急性髓系白血病)最終因為微小殘留白血病(minimalresidualleukemia,MRL)的存在而復發(fā)甚至死亡,因此清除MRL是治愈白血病的關鍵。此前,本課題組采用自身DC聯(lián)合CIK(DC-CIK)細胞和中藥治療白血病取得較好療效,但自身DC-CIK細胞治療受患者身體狀況、免疫機能等因素影響,其推廣應用受到限制。本研究觀察異體DC-CIK聯(lián)合化療治療形態(tài)學完全緩解期(completeremission,CR)但未達到分子學完全緩解(molecularCR,CRm)或MRL陽性的白血病患者的臨床效果及其治療安全性。1材料和方法1.1病例選擇及化療方案選取48例2009年1月至2011年6月石家莊平安醫(yī)院收治的白血病患者(本組病例不含PML/RARα陽性急性髓系白血病),按照WHO急性白血病診斷分型標準均診斷為CR期,但均未達CRm,或四色流式細胞微小殘留白血病免疫表型組合(four-colorcombinationflowcytometricimmunophenotypeofminimalresidualleukemia,CFIM)陽性。按照患者意愿入選聯(lián)合組24例,采用DC-CIK細胞聯(lián)合鞏固化療;選擇24例同期化療患者作為對照的化療組,僅采用鞏固化療。兩組患者在性別、年齡、緩解期、病種分布、相關基因表達等方面差異無統(tǒng)計學意義(表1)。健康半嵌合供體是經相關病毒學檢查和健康體檢合格的患者的父母或子女。兩組患者和供者均簽署知情同意書,研究程序和治療方案經醫(yī)院倫理委員會審查批準。1.2cik細胞的增殖培養(yǎng)選擇健康半嵌合供者進行有核細胞分離,采集前用粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF)進行體外動員,當外周血細胞密度達(3~5)×1010個/L時用血細胞分離機按Auto-PBSC程序行血細胞分離,并用淋巴細胞分離液(Ficoll)分離出單個核細胞,AIM-V無血清培養(yǎng)基調整細胞密度為(4~6)×106個/ml,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。此時培養(yǎng)基中出現(xiàn)非貼壁細胞和貼壁細胞。收集非貼壁細胞并調整細胞密度為(1~2)×106個/ml,加入1000U/ml的IFN-γ懸浮培養(yǎng)24h,加入1μg/ml的CD3單克隆抗體和1000U/ml的IL-2,每隔3d換液1次,同時補充IL-2和CD3單克隆抗體,調整細胞密度為(1~2)×106個/ml進行增殖培養(yǎng),收獲CIK細胞。收集AIM-V無血清培養(yǎng)基中的貼壁細胞,在AIM-V培養(yǎng)液中加入1000U/ml的GM-CSF和1000U/ml的IL-4,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3d換液1次并補充細胞因子,第6天加入上述細胞因子的同時還加入IL-1β、TNF-α、PGE-2等細胞因子誘導DC成熟,培養(yǎng)7~8d后收獲DC。計數(shù)收獲的DC和CIK細胞,將其按1∶3的比例混合,共培養(yǎng)6d,獲得DC-CIK細胞。1.3cik細胞免疫表型檢測在DC培養(yǎng)的第8天用流式細胞儀行DC免疫表型(CD86+、CD11+)分析;在CIK細胞培養(yǎng)的第8、14天分別取少量細胞,應用流式細胞儀做CIK細胞免疫表型(CD3+、CD4+、CD8+、CD56+)分析。DC-CIK細胞培養(yǎng)物共培養(yǎng)6d后再次檢測以上表型。采用熒光標記的單抗進行染色,用COULTEREPICSXL型四色流式細胞儀檢測,用CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。1.4細胞表型檢測DC-CIK細胞混合液進行乙肝、丙肝、梅毒、HIV病毒檢測均呈陰性,同時微生物、霉菌培養(yǎng)也均陰性;錐蟲藍染色檢測細胞活性達到90%,淋巴細胞比例≥70%;有核細胞計數(shù)達1.0×107~2.0×108個/ml;檢測細胞表型CD86+、CD11+、CD3+、CD4+、CD8+、CD56+表達30%~50%時,準備輸注。輸注前地塞米松5mg靜脈注射以防止過敏,生理鹽水250ml輸注時前后沖液路。當天輸注4~6h后再靜脈輸入生理鹽水100ml+IL-2(2.0×105U),次日起輸入生理鹽水100ml+IL-2(2.0×105U),1次/d,共4d。每15d輸注1次,輸注4~6次后判斷療效。1.5阿糖胞苷、ma、ea、米托、阿糖胞苷、ma、ma、ma、ea、ma、ma、ea、h參照2009年急性髓系白血病治療的專家共識,采用TA(吡柔比星、阿糖胞苷)、HA(高三尖杉酯堿、阿糖胞苷)、MA(米托蒽醌、阿糖胞苷)、EA(依托泊甙、阿糖胞苷)、IDAD(中劑量阿糖胞苷、柔紅霉素)交替化療,每1~3個月用1次(療程5~7d)。兩組病例化療方案、療程間歇期相同。1.6cbf/mih11每次骨髓檢查時檢測白血病特異基因或相關基因,包括AML1/ETO,CBFβ/MYH11,BCR/ABL、WT1、IgH基因重排和TCRδ基因重排。連續(xù)2次陰性則每3~6個月再檢測1次,持續(xù)陰性1年以上則每6~12個月檢測1次,再檢測2次。1.7cfim、cfim的比較根據(jù)患者初發(fā)病時的白血病細胞免疫表型確定其CFIM。每次骨髓檢查時檢查CFIM,連續(xù)2次陰性后每3~6個月再檢測1次,持續(xù)陰性1年以上則每6~12個月檢測1次,再檢測2次。1.8流式細胞培養(yǎng)檢測t淋巴結亞組治療前后用流式細胞儀檢測所有48例的CD4+、CD8+T細胞比例,比較治療前后的變化。1.9dc-cik輸注前后檢查指標(1)DC-CIK輸注次數(shù)和輸注量;(2)疾病狀態(tài);(3)每次DC-CIK輸注前后檢查患者肝腎功能、心電圖、尿液常規(guī)、大便常規(guī)。在輸注DC-CIK過程中及輸注后每天觀察出現(xiàn)的不良反應,觀察項目及分級參照世界衛(wèi)生組織規(guī)定的急性及亞急性毒性反應標準。1.10研究對象的一般情況療效評價參照《血液病診斷及療效標準》中急性白血病療效標準和國際工作組關于急性髓系白血病治療試驗的診斷、療效標準的標準化、治療結局和報告標準的修訂建議。本研究臨床隨訪至2012年6月,觀察并統(tǒng)計研究對象的CR、CCR、PR、NR和復發(fā)情況;同時對患者進行分子血液學指標檢測,以判斷患者的MRL的清除程度:(1)CRm:治療前表達白血病特異基因或相關基因,治療后轉為陰性。本研究規(guī)定檢測基因低于1000個拷貝為該基因陰性。(2)CFIM轉陰:本研究參照文獻的規(guī)定,CFIM檢測MRL細胞數(shù)<0.01%為陰性。(3)MRL清除:本研究規(guī)定,連續(xù)2次白血病特異基因或相關基因陰性,或連續(xù)2次CFIM陰性,判定為MRL清除。1.11ccr生存期計算采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。計數(shù)資料以百分率表示,采用χ2檢驗;計量數(shù)據(jù)以表示,采用t檢驗;CCR生存期采用Kaplan-Meier法計算。以P<0.05或P<0.01表示差異具有統(tǒng)計學意義。2結果2.1cik細胞生長和免疫的變化DC細胞培養(yǎng)體系中,剛分離的外周血單個核細胞呈球形,表面光滑,培養(yǎng)2~3h后,可見部分貼壁細胞,呈圓形,均勻散在分布;誘導培養(yǎng)3~4d后,為均勻散在分布的聚集體,胞體稍增大,形態(tài)不規(guī)則,細胞表面開始出現(xiàn)細小的樹突狀偽足;培養(yǎng)6~7d后,胞體變得更大,表面出現(xiàn)大量毛刺狀突起,具有典型樹突狀的細胞約占50%~60%,部分細胞呈半貼壁懸浮狀態(tài)。DC細胞免疫表型檢測結果顯示,CD86+細胞占(53.4±8.3)%,CD11+細胞占(50.3±9.8)%。CIK細胞培養(yǎng)體系中,非貼壁細胞在前3d內成團簇樣生長,細胞團逐漸增多、增大、懸浮,細胞形態(tài)呈圓形、規(guī)則、透亮,在7~12d的增殖速度最快。非貼壁細胞初始數(shù)量平均為(1.7±0.3)×106個,第7天細胞總數(shù)約為(4.9±0.8)×107個,平均增長了30倍;第14天CIK細胞總數(shù)達(3.6±0.7)×109個。CIK細胞免疫表型檢測結果:CD3+CD4+細胞占(25.3±7.2)%,CD3+CD8+細胞占(65.6±10.1)%,CD3+CD56+細胞占(30.1±5.4)%。2.2納入和排除治療的治療情況聯(lián)合組24例共接受114次DC-CIK細胞治療,其中15例接受4次治療,9例接受6次治療。每次輸注的DC-CIK細胞總數(shù)為1×109~26.5×109個細胞,平均輸注量為(8.1±4.3)×109個/次。2.3u3000b細胞急性紅細胞白酒達cr聯(lián)合組有11例達CRm,其中1例輸注1次DC-CIK細胞后白血病相關基因陰轉,3例3次后陰轉,4例4次后陰轉,2例5次后陰轉,1例6次后陰轉,CRm率為45.7%。達CRm所需時間為15~60d,平均為(40.7±12.2)d。11例白血病相關基因轉陰患者包括4例AML1/ETO、3例CBF/MYH11、1例WT1、3例IgH基因重排B細胞急性淋巴細胞白血病(曾間斷化療4年IgH基因重排仍為陽性)?；熃M白血病相關基因陰轉2例,CRm率為8.3%,其中1例AML1/ETO基因,1例IgH基因重排;達CRm所需時間分別為6個月和11個月。兩組CRm率的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.55,P<0.01)。采用DC-CIK細胞聯(lián)合化療達CRm的典型病例:一例BCFβ/MYH11基因陽性急性髓細胞性白血病患者,男性,24歲,化療取得緩解后只鞏固1個療程,即用DC-CIK治療,DC-CIK細胞輸注3次后BCFβ/MYH11陰轉,至今保持陰性達48個月。另一例緩解后鞏固治療的B細胞急性淋巴細胞性白血病患者,堅持間斷化療4年,IgH基因持續(xù)陽性,停用化療,采用DC-CIK細胞治療3次后IgH基因陰轉,保持陰性至今達42個月。可見DC-CIK細胞聯(lián)合化療,對促進白血病相關基因陰轉,取得CRm有確切的效療。2.4cfim陰轉和各基因型分布聯(lián)合組CFIM轉為陰性水平者16例,CFIM轉陰率66.7%。CFIM轉陰者包括4例AML1/ETO陽性急性髓性白血病、3例BCFβ/MYH11基因陽性急性髓系白血病、1例WT1基因陽性AML-2、3例IgH基因重排B細胞急性淋巴細胞白血病、3例AML-M2、1例AML-M4和1例AML-M5患者。CFIM陰轉的中位時間為60d,均為DC-CIK細胞輸注3次以上者?；熃MCFIM轉為陰性者6例,CFIM陰轉率25.0%,其中1例AML1/ETO基因、1例IgH基因重排、3例AML-M2、1例AML-M4患者。聯(lián)合組CFIM陰轉率較化療組顯著提高(χ2=8.39,P<0.01)。2.5化療組和對照組的ml陰性比較聯(lián)合組16例達MRL陰性,清除率66.7%;化療組6例達MRL陰性,清除率25.0%。兩組MRL清除率差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=8.39,P<0.01)。2.6cd4+t/cd8+t細胞比值的變化聯(lián)合組患者治療后外周血中CD4+T細胞比例、CD8+T細胞比例無顯著的變化(P>0.05),但CD4+T/CD8+T細胞比值顯著上升[(1.3±0.4)vs(0.8±0.4),P<0.05];而化療組治療前后外周血淋巴細胞亞群比例無明顯變化(P>0.05)(表2)。2.7化療組與cr、3年以上ccr比較隨訪至2012年6月,中位隨訪時間為32個月(12~38個月)。聯(lián)合組24例中19例保持CR達3年以上,3年以上CCR達79.2%;僅5例在3年內復發(fā)?；熃M24例中11例CR達3年以上,3年以上CCR達45.8%;13例在3年內復發(fā)。聯(lián)合組患者3年以上CCR率較化療組顯著提高(χ2=5.69,P<0.05)。2.8地塞米松緩沖劑DC-CIK細胞輸注后,6例患者出現(xiàn)發(fā)熱,體溫37.5~40.2℃,多發(fā)生于細胞輸注后0.5~2h,持續(xù)1~3h消退,伴有全身乏力、肌肉酸痛,用地塞米松能很快緩解。未見外周血紅細胞、白細胞及血小板的明顯降低,無肝功、腎功、心肌酶、血糖及電解質的異常變化。隨訪至2012年6月,未見患者的心、肝、腎等重要器官功能損害,未見感染性疾病、第二腫瘤等發(fā)生。3異體dc-cik細胞聯(lián)合化療的安全性分析目前,化療可使多數(shù)急性白血病獲得CR,CR后除M3型及兒童標準危險組B細胞ALL外,其他患者的長期CCR率<50%,多數(shù)<30%,其原因多為MRL得不到清除而復發(fā),因此急性白血病CR后MRL的清除仍是治療的重點和難點。化療對MRL作用有限,采用細胞免疫治療清除MRL是目前的研究熱點。體外研究發(fā)現(xiàn),健康人外周血單個核細胞誘導DC和CIK細胞,由于DC能夠增加CIK細胞的增殖能力和抗白血病活性,將DC與CIK細胞共培養(yǎng)所獲得的DC-CIK細胞有顯著的抗白血病作用,對耐藥白血病細胞和白血病干細胞也有殺傷作用。DC-CIK細胞抗白血病機制主要有:(1)CIK細胞對白血病細胞的直接殺傷,在體內受某些淋巴因子作用后,CIK細胞大量釋放具有細胞毒性的胞質顆粒到胞外,這些顆粒直接破壞腫瘤細胞;(2)進入體內的DC-CIK細胞分泌多種細胞因子,如干擾素-γ、TNF-α和IL-2等,不僅對白血病細胞有直接抑制作用,而且還可通過調節(jié)免疫系統(tǒng)間接殺傷白血病細胞;(3)CIK細胞由于有抗凋亡基因表達,因此在體內能抵抗FasL陽性白血病細胞對CIK細胞的反作用,故CIK細胞能對白血病細胞持久地發(fā)揮作用。鄧琦等采用自身DC皮下注射聯(lián)合CIK靜脈輸注治療34例緩解后急性白血病,所有患者治療結束后均處于血液學和遺傳學緩解狀態(tài),T細胞亞群、細胞因子水平和微小殘留病灶檢測取得滿意結果,治療期間8例出現(xiàn)一過性低熱反應,無其他不良反應。周東風等回顧性總結了47例兒童急性白血病患者緩解后采用自身骨髓培養(yǎng)的DC-CIK細胞靜脈回輸治療,結果顯示,CCR率達93.62%,治療前MRL陽性的9例患兒8例治療后轉陰,治療中少數(shù)患者僅見發(fā)熱、皮疹輕微不良反應,隨訪5~72個月未見心、肝、腎等重要器官功能損害,未見感染性疾病、第二腫瘤等的發(fā)生。白血病復發(fā)的