利用b淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備麻痹性貝毒的單克隆抗體

麻痹性苦艾酒，晉江，是一種含有雙冠維c的三氟乙醇（圖1），具有四羥吡啶的基本結(jié)構(gòu)。晉江分布在世界各地。根據(jù)不同的地理分布，主要成分也不同。最常見的是膝溝藻素（gonama3、gtx2、sabistax）和石腦藻素（sabistax）。stx通常占sd的85%以上。stx是邢氏家族的主要研究對象。因此，在該項(xiàng)目中，stx是半抗原生動(dòng)物檢測psp的單克隆抗體。PSP在弱酸和低溫條件下比較穩(wěn)定,通常的烹調(diào)方法不能改變其結(jié)構(gòu)及降低其毒性,主要污染濾食性貝類,污染的貝類被人類食用后,會(huì)產(chǎn)生四肢面部肌肉麻痹、頭痛惡心等癥狀,嚴(yán)重時(shí)可窒息死亡。由于PSP分布廣泛、危害嚴(yán)重,引起各國的普遍重視,因此建立快速、靈敏、有效地毒素檢測方法顯得十分迫切。目前國際上普遍使用的貝毒監(jiān)測方法主要是生物小鼠法和高效液相色譜法(HPLC),但生物法存在誤差性大、重現(xiàn)性差,且存在不能分析樣品中具體組分的缺點(diǎn);而HPLC法能夠精確地測定毒素的種類和含量,但需要對樣品進(jìn)行繁瑣的前處理和購買昂貴的設(shè)備。因此,海洋生物樣品中麻痹性貝毒的監(jiān)測就受到了嚴(yán)重的限制。酶聯(lián)免疫吸附檢測方法(Enzyme-linkedimmolunosorbentassay,ELISA)克服了上述技術(shù)的局限性,為我們提供了一種快速、敏感而且操作簡單的分析方法,在小分子化合物的檢測中應(yīng)用已經(jīng)十分廣泛。本研究旨在制備可用于檢測海洋生物體內(nèi)的PSP的單克隆抗體,對于研發(fā)國產(chǎn)PSP檢測試劑盒具有重要的意義。1材料和方法1.1材料表面1.1.1細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0由本室保存。動(dòng)物為6～8周齡雌性BALB/c小鼠(體重18～21g),購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.1.2tmb底物溶液STX標(biāo)準(zhǔn)品(臺(tái)灣人宇公司);其他PSP系列標(biāo)準(zhǔn)溶液均購自加拿大海洋生物科學(xué)研究所(NRC);血藍(lán)蛋白(KLH),卵清白蛋白(OVA),牛血清白蛋白(BSA),二甲基亞砜(DMSO),聚乙二醇(PEG),HAT、HT培養(yǎng)液均購自Sigma公司;TMB底物溶液(3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺、磷酸鹽-檸檬酸緩沖液、過氧化脲、EDTA-2Na、DMSO)為本實(shí)驗(yàn)室自行配制;RPMI1640和胎牛血清購于Gibco公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG(華美生物工程有限公司)。二氧化碳培養(yǎng)箱(ThermoFormaSeriesⅡ)、倒置顯微鏡(Nikon100),超凈工作臺(tái)(CA-1390-1),高速冷凍離心機(jī)(Sigma3K18),微量移液器(Gilson),快速高壓滅菌鍋(TomySS-325),電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9272),酸度計(jì)(PHS-2C),鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9000),酶標(biāo)儀(BIO-RADModel680),洗板機(jī)(Thermolabsystems)。1.2方法1.2.1血藍(lán)蛋白al-4天進(jìn)階,在形成良好的血藍(lán)蛋白上,將其作為蛋白膠原,將0.5mg石房蛤毒素STX溶于250μlPBS緩沖液(pH=6.5)中,加入75μl37%的甲醛,迅速加入500μl血藍(lán)蛋白KLH(10mg/ml),25℃,振搖37小時(shí),4℃過夜后,PBS緩沖液(pH=6.5)透析3天,用做免疫抗原。包被抗原STX-OVA偶聯(lián)方法同上。1.2.2單次注射x-drh以STX-KLH為免疫原,免疫5只6～8周齡的雌性BALB/c小鼠。首次免疫用75μlSTX-KLH與等體積完全弗氏佐劑,充分乳化后,注射腹腔小鼠,第3、5、7、9、11周取同量STX-KLH與等體積不完全弗氏佐劑充分乳化,腹腔注射。每次注射前由尾部取血測定小鼠血清的效價(jià),待效價(jià)大于要求值后,融合的前3天,取100μlSTX-KLH的PBS溶液腹腔注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫。1.2.3酶標(biāo)板的測定用STX-OVA偶聯(lián)物作為包被抗原,用碳酸鹽緩沖液(pH=9.6)稀釋到適當(dāng)濃度添加到96孔酶標(biāo)板,每孔100μl,4℃過夜;棄去殘液,洗滌三次、拍干,96孔酶標(biāo)板每孔加入300μl封閉液,37℃孵育3小時(shí),封閉好的96孔酶標(biāo)板可保存在4℃數(shù)周待用;測定時(shí),棄去封閉液,洗板三次,拍干,加入適當(dāng)稀釋的血清或細(xì)胞培養(yǎng)上清,每孔100μl,37℃溫箱中孵育1小時(shí);從溫箱中取出酶標(biāo)板,洗板、拍干,加入適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)羊抗鼠第二抗體,每孔100μl,37℃溫箱中孵育40分鐘;洗板、拍干,每孔加TMB底物溶液100μl,37℃孵育10～20分鐘,以0.05mol/LH2SO4每孔50μl中止反應(yīng),450nm波長測定OD值。1.2.4elisa檢測抗pvc的細(xì)胞系取生長狀態(tài)良好的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫好的小鼠脾細(xì)胞按照1∶5的比例進(jìn)行混合,加入促融劑PEG0.7ml進(jìn)行細(xì)胞融合,在20%胎牛血清的HAT培養(yǎng)基中選擇性培養(yǎng),融合后的第3天換半液,4～6天有細(xì)胞克隆形成,取細(xì)胞培養(yǎng)液上清進(jìn)行ELISA檢測,選取陽性細(xì)胞孔,用有限稀釋法克隆,篩選可穩(wěn)定分泌抗PSP的單克隆抗體的細(xì)胞系,陽性孔需要經(jīng)過連續(xù)克隆3～4次,最后一次克隆后檢測陽性率為100%時(shí),則所得細(xì)胞株即為分泌單克隆抗體的陽性細(xì)胞株。陽性細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后,用于腹水制備和液氮長期保存。1.2.5elisa法檢測陽性雜交瘤細(xì)胞的及其有效發(fā)揮取6～8周齡雌性BALB/c小鼠6只,每只腹腔注射0.5ml液體石蠟,1～2周后可用于注射雜交瘤細(xì)胞制備腹水。1200r/min離心10分鐘收集陽性雜交瘤細(xì)胞,用生理鹽水調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/ml,在液體石蠟處理過的小鼠腹腔內(nèi)注射0.5ml陽性細(xì)胞懸液,注射7～10天后可見小鼠腹部明顯膨大,收集腹水,3000r/min,4℃,離心10分鐘,收集上清液即為含單克隆抗體腹水,用間接ELISA方法測定腹水效價(jià),-84℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?.2.6修訂2.5mol/lPSP系列標(biāo)準(zhǔn)溶液包括:①C毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液:C1(5.7μmol/L)、C2(1.75μmol/L);②膝溝藻毒素Gonyautoxins(GTXs)標(biāo)準(zhǔn)工作液:GTX1(2.65μmol/L)、GTX2(2.95μmol/L)、GTX3(0.975μmol/L)、GTX4(0.875μmol/L)、GTX5(1.625μmol/L)、dcGTX2(2.85μmol/L)、dcGTX3(0.8μmol/L);③石房蛤毒素Saxitoxins(STXs)標(biāo)準(zhǔn)工作液:neo-STX(6.5μmol/L)、dcSTX(6.2μmol/L)、STX(6.5μmol/L),將上述PSP用PBS稀釋成各濃度的使用液:15.625、31.25、62.5、125、250、375和500ng/ml共7個(gè)梯度。1.2.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制96孔板的包被和封閉見1.2.3。測定時(shí)棄去封閉液,洗板3次,每孔加入50μl稀釋的腹水和50μl系列稀釋的各種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液或待測樣品溶液,振蕩混勻,37℃孵育1小時(shí),其他步驟同血清或上清效價(jià)測定。以加入不同濃度的PSP系列標(biāo)準(zhǔn)物孔的吸光度值與空白對照孔的吸光度值比為縱坐標(biāo),相應(yīng)的PSP系列標(biāo)準(zhǔn)的濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出各標(biāo)準(zhǔn)物抑制率為50%時(shí)所需的濃度即IC50,交叉反應(yīng)率為STX的IC50與其它同系物IC50的比值。交叉反應(yīng)率=ΙC50SΤXΙC50同系物×100%。1.2.8催化劑和儀器稱取一定量的貝類樣品勻漿,用0.1mol/L的鹽酸溶液按照1∶1萃取,煮沸5分鐘,8000r/min離心20分鐘,取上清液,孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾,HPLC分析。HPLC條件為:GTX毒素流動(dòng)相(主要針對GTX1～GTX5、dcGTX2和dcGTX3):4.3mmol庚烷磺酸鈉與10mmol磷酸銨的混合液,磷酸調(diào)pH至7.1,0.45μm過濾;STX毒素流動(dòng)相(主要針對STX、neoSTX和dcSTX):2mmol庚烷磺酸鈉與30mmol磷酸銨的混合液,磷酸調(diào)pH至7.1,0.45μm過濾膜:乙腈(20∶1);流速:0.8ml/min;進(jìn)樣量:5μl;HPLC-FLD檢測器激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為330nm和390nm;氧化劑:7mmol高碘酸與50mmol磷酸鉀混合液,以磷酸調(diào)節(jié)pH至9.0;酸化劑:0.5mol/L醋酸;流速:柱后氧化劑流速0.4ml/min,酸化劑流速為0.4ml/min;柱后反應(yīng)溫度:75℃。1.2.9生物大鼠法分析xml按照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)“貝類中麻痹性貝類毒素的測定”中規(guī)定的方法進(jìn)行(GB/T5009.213-2008)。2結(jié)果2.1stx-glh偶聯(lián)比由于合成的STX-KLH首次免疫過后,剩下的合成抗原在第二次免疫時(shí),3只鼠均死亡,且臨死時(shí)均有典型的麻痹性貝毒上串抽搐而死的特征表現(xiàn),計(jì)算出PSP含量為43.4eqSTXμg/100g。據(jù)此得出STX-KLH偶聯(lián)比為STX∶KLH=10∶1。為防止分解,每次免疫之前現(xiàn)合成免疫抗原,包被抗原也如此。2.2免疫大鼠血清效果以STX-KLH為免疫抗原,免疫8次后兩只BALB/c小鼠血清對STX-OVA的效價(jià)均在400左右。2.3陽性混合腫瘤的細(xì)胞株2.3.1elisa法檢測抗體表達(dá)免疫的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0用PEG融合,每只鼠20塊96孔細(xì)胞板,HAT培養(yǎng)基篩選培養(yǎng),當(dāng)每孔雜交瘤細(xì)胞覆蓋孔底30%～50%時(shí),ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗體分泌情況,陽性率為4.5%。其中僅有8個(gè)陽性細(xì)胞孔有較明顯抑制作用,將上述8個(gè)陽性細(xì)胞孔進(jìn)行有限稀釋法克隆,最終獲得4株能穩(wěn)定分泌抗PSP特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為17#E8、17#D8、17#G6和17#F9。經(jīng)過連續(xù)傳代10代及凍存1個(gè)月后復(fù)蘇、ELISA效價(jià)檢測顯示該細(xì)胞株分泌抗體仍為強(qiáng)陽性,效價(jià)與原代細(xì)胞一致,證明這4株細(xì)胞具有穩(wěn)定分泌抗體的能力。2.3.2抗體的活性4株陽性細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后,細(xì)胞上清液的吸光度值見表1,結(jié)果表明該雜交瘤細(xì)胞株具有能分泌較高濃度的PSP抗體的能力。通過小鼠腹腔注射陽性細(xì)胞株誘生腹水的方法,4株雜交瘤細(xì)胞株均能誘導(dǎo)出高效價(jià)的含抗PSP單克隆抗體的腹水,細(xì)胞株17#E8和17#F9誘生的腹水效價(jià)均在2×104以上(圖2)。2.4間接競爭elisa方法分析了psp的不同組成部分2.4.1x-ova的稀釋和濃度用點(diǎn)陣法確定了競爭ELISA方法的包被抗原STX-OVA最佳稀釋度為1∶500;腹水的稀釋倍數(shù)為1∶1000;HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗的濃度為1∶1000;底物顯色液的時(shí)間為18分鐘。2.4.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測以抗原STX標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對數(shù)為橫坐標(biāo),結(jié)合率為縱坐標(biāo),繪制結(jié)合率反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。線性回歸方程為y=-0.1696x+1.4901,R2=0.9785。求出抑制率為50%時(shí)所需的STX標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度(IC50)為220ng/ml,對STX組分的檢出限為20ng/ml。用間接競爭ELISA方法檢測PSP系列其余標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的抑制反應(yīng)(圖4),從中可以看出該抗體對其余PSP組分幾乎沒有抑制,僅對GTX2/3有明顯的抑制效果,IC50為50ng/ml,檢出限為10ng/ml。由上述結(jié)果可知,該抗體對GTX2/3的交叉反應(yīng)率為440%,其他組分交叉反應(yīng)率均低于1%。表明所制備的單克隆抗體對PSP中的STX組分和GTX2/3組分具有高特異性。2.5成對t檢驗(yàn)結(jié)果分別用HPLC方法、生物小鼠法與ELISA方法分析78個(gè)貝類生物樣品,用SPSS11.0軟件分別進(jìn)行成對t檢驗(yàn)分析,結(jié)果顯示:HPLC方法與ELISA方法在針對GTX2/3組分的檢測時(shí),相關(guān)系數(shù)為0.9082、在針對PSP的檢測時(shí),相關(guān)系數(shù)為0.8647;用生物小鼠法與ELISA方法在分析貝類體內(nèi)PSP含量時(shí),相關(guān)系數(shù)為0.8611。3elisa法測體外蛋白中n-b、n-pb-l近些年來,免疫檢測技術(shù)在抗生素、農(nóng)藥和毒素等小分子化合物殘留分析中的應(yīng)用越來越廣泛,而抗體的制備則是建立免疫檢測技術(shù)的關(guān)鍵。由于PSP各組分的分子量均在300Da左右,沒有免疫原性,合成高質(zhì)量的人工抗原較困難;STX標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴,來源渠道極少,限制了關(guān)于建立PSP的ELISA分析方法的研究。抗原合成的原則是半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)位置最好遠(yuǎn)離重要的抗原決定簇,從而使遠(yuǎn)離聯(lián)結(jié)位點(diǎn)的半抗原部分具有較好的識(shí)別能力,進(jìn)而獲得效價(jià)高、特異性好的抗體,本實(shí)驗(yàn)以甲醛通過縮水反應(yīng)分別將蛋白質(zhì)KLH、OVA的氨基與STX的胍基連接起來,成功合成了具有免疫原性的免疫抗原和包被抗