實驗十三流式細胞技術檢測腫瘤治療藥物誘導的細胞凋1.實驗目的了解細胞凋亡、及流式細胞技術原理等基本知識。學習細胞凋亡的形態(tài)學觀察和流式細胞術檢測的方法。2.實驗原理2.1細胞凋亡的基礎知識2.2流式細胞技術的一般原理及應用2.3用流式細胞術檢測細胞凋亡的原理2.1細胞凋亡的基本知識：定義：細胞凋亡是細胞在一定程序控制下的自主死亡過程。細胞凋亡同細胞分裂、細胞分化一樣是機體生存和發(fā)育離不開的最基本的生物現(xiàn)象，通過凋亡可以平衡機體內(nèi)細胞的數(shù)目，清除衰老、過剩、有害的細胞。細胞凋亡異常會引起免疫性疾病或腫瘤等。

（一）、細胞壞死是細胞受到急性強力傷害時立即出現(xiàn)的反應。早期表現(xiàn)為細胞膜破壞，線粒體腫脹。繼而溶酶體破裂,細胞內(nèi)容物流出,引起炎癥。細胞凋亡與壞死的區(qū)別細胞凋亡與壞死的區(qū)別（二）細胞凋亡cellapoptosis

Kerr（1972）最先提出，與細胞壞死的區(qū)別是：①細胞通過出芽的方式形成許多凋亡小體；②凋亡小體內(nèi)有結(jié)構(gòu)完整的細胞器；③不引起炎癥；④線粒體無變化，溶酶體活性不增加；⑤內(nèi)切酶活化，DNA有控降解，凝膠電泳圖譜呈梯狀；⑥凋亡通常是生理性變化，而細胞壞死是病理性變化。細胞凋亡與壞死的區(qū)別胸腺細胞正常凋亡形態(tài)學檢測流式細胞法檢測DNALadder檢測熒光法檢測凋亡鑒定方法2.2流式細胞技術的一般原理及應用

流式細胞術(flowcytometry)是以流式細胞儀(flowcytometer，F(xiàn)CM)為工具，在液流系統(tǒng)中對懸液中的單個細胞、細胞器或生物粒子的生物、物理和化學特性進行快速測量并自動分析，并根據(jù)這些特性將所需要的細胞或細胞器從群體中加以分類收集的高技術。它的主要特點是，可以在單細胞水平上對大量細胞進行快速、準確、多參數(shù)的定量分析及分選，借此判斷細胞的體積、DNA含量、蛋白質(zhì)含量、酶活性、細胞膜受體和表面抗原等許多重要參數(shù)，并可在無菌狀態(tài)下，對活細胞進行分類收集，收集的純度可達99％。

流式細胞儀工作原理

流式細胞儀（FlowCytometer）集激光技術、電子物理技術、光電測量技術、電子計算機技術、細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的一種新型高科技儀器。散射光信號FALSSensorLaser散射光信號RightAngleLightDetector

CellComplexitySSCForwardLightDetector

CellSurfaceArea

FSCIncidentLightSource前向角散射光（FSC,ForwardScatter） 細胞相對大小及其表面積側(cè)向角散射光（SSC,SideScatter） 細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復雜性外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖（紅細胞溶解后）流式細胞儀的檢測信號熒光信號使用熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量熒光信號雙色直接染色數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)存儲:LISTMODE數(shù)據(jù)顯示: 直方圖(Histogram) 二維點圖(DotPlot) 等高線圖(ContourPlot) 密度圖(Density) 三維圖（3DPlot）等數(shù)據(jù)分析直方圖分析數(shù)據(jù)分析點圖分析數(shù)據(jù)分析等高圖和密度圖分析2.3用流式細胞術檢測細胞凋亡的原理利用流式細胞儀測定細胞光散射可對凋亡細胞進行分析。凋亡早期細胞因體積減小，胞漿及染色質(zhì)固縮，F(xiàn)SC變小，SSC增大，凋亡晚期細胞FSC、SSC均變小，壞死細胞則因細胞膜通透性改變，細胞腫脹，F(xiàn)SC、SSC變大，胞膜破裂，胞內(nèi)含物釋出后FSC、SSC均變小。用流式細胞儀也可以根據(jù)DNA含量不同，從細胞群體中鑒別凋亡細胞。凋亡細胞在G1峰前出現(xiàn)亞二倍體峰，即凋亡峰（Ap峰）。通過此峰下的面積值可得出凋亡細胞在所測細胞群中所占的比率（用凋亡軟件定量）。另外，細胞凋亡受基因調(diào)控，有賴于某些蛋白質(zhì)的合成，用流式細胞儀可同時測定凋亡細胞的FSC/SSC及DNA/蛋白質(zhì)，進行多參數(shù)分析以研究不同的凋亡誘導作用機制。3.實驗材料、用品實驗材料：培養(yǎng)的Hela細胞實驗用品：①儀器與用具C02培養(yǎng)箱，超凈工作臺，倒置顯微鏡和離心機等。微量加樣器(1μl-1ml)，0.5ml和1.5ml的Eppendorf管，20μl、200μl和1ml吸頭，10ml培養(yǎng)瓶，載玻片，蓋玻片等。②試劑放射線菌素D（誘導細胞凋亡的腫瘤治療藥物，如喜樹堿、紫杉醇、中藥砒霜等）；熒光探針：用PBS(pH7.4)將PI配成500μg/ml的貯液，在-20℃凍存。FACSCalibur,BDBioscience4.實驗步驟Hela細胞的傳代培養(yǎng)誘導細胞凋亡：向?qū)?shù)生長期細胞中加入放射線菌素D（可結(jié)合科研采用其他誘導細胞凋亡的腫瘤治療藥物）分別為0.25、0.5、1、2、4mg/L,作用6小時。用胰酶消化以上五個樣本以及對照的細胞，吹打收集于離心管中，1000r/min下離心8分鐘，倒去上清。加約1mlPBS重懸細胞，用注射器迅速注入到4ml4℃的70%的酒精中，固定8小時以上。去上清，用PBS4ml重懸細胞，再1000r/min下離心8分鐘，去上清控干液體后加0.3mlPBS，加入RNA酶A至終濃度為50ug/ml，37℃孵育30分鐘。將樣品插到冰浴中，停止酶的作用。待冷卻后加入50ug/ml的PI1.5ml,放于冰上在冰箱中染色至少30分鐘。3個小時之內(nèi)在流式細胞儀上檢測樣品。5.實驗結(jié)果正常凋亡化療前后胃癌活檢標本中Caspase-3+細胞化療前(3.49%)化療后(94.86%)26細胞凋亡——PI分析PI-Fluorescence#Events凋亡細胞正常G0/G1期細胞6.注意事項細胞數(shù)目要充