rs組分對(duì)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生廣抗菌肽bac-j23的影響

抗感菌活性是指在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一種具有抗菌活性的蛋白質(zhì)或茶多酚。它被認(rèn)為是天然食物制劑和飼料添加劑，具有廣闊的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景，但低發(fā)酵合成能力是限制大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用的瓶頸之一。目前對(duì)抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)的優(yōu)化研究主要集中在培養(yǎng)基優(yōu)化、培養(yǎng)環(huán)境、發(fā)酵方式等方面。前人研究發(fā)現(xiàn),Nisin發(fā)酵中最佳的碳源是葡萄糖和蔗糖,乳酸鏈球菌分泌合成Nisin培養(yǎng)基關(guān)鍵組分為氮源;PO43-對(duì)Nisin合成具有刺激效果,Ca2+能明顯促進(jìn)Nisin的活性,但Mn2+對(duì)Nisin的合成具有負(fù)面影響。本課題組前期從我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中成功篩選獲得一株產(chǎn)廣譜抗菌肽Bac-J23的乳酸菌LactobacillusJ23,為了開(kāi)展該菌株發(fā)酵合成抗菌肽Bac-J23的研究,對(duì)乳酸桿菌培養(yǎng)專用MRS培養(yǎng)基的組分對(duì)Bac-J23合成影響進(jìn)行了研究,旨在選擇一種既適合LactobacillusJ23生長(zhǎng)且利于Bac-J23合成的組分相對(duì)簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基,為將來(lái)從發(fā)酵代謝角度對(duì)LactobacillusJ23合成廣譜抗菌肽Bac-J23進(jìn)行調(diào)控奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1蘑菇乳酸菌LactobacillusJ23由本實(shí)驗(yàn)室分離。1.1.2mnmn-3-苯基液mse蛋白胨10g,肉膏10g,酵母提取物10g,檸檬酸二銨2g,K2HPO42g,葡萄糖20g,乙酸鈉5g,MnSO4·4H2O0.25g,吐溫801mL,MgSO4·7H2O0.58g,加水至1000mL,調(diào)pH值至6.3,121℃滅菌15min。葡萄糖溶解于200mL水中單獨(dú)滅菌后混合。1.2儀器、設(shè)備和顆粒pH計(jì),德國(guó)SartoriusAGPB-10;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀器有限公司);無(wú)菌操作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);生化培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠);電子天平(賽多利斯有限公司);電子水浴鍋(江蘇國(guó)華儀器廠);滅菌鍋(上海華線核子儀器有限公司);離心機(jī)(湖南星科儀器有限公司)。1.3方法1.3.1最佳碳源的確定對(duì)葡萄糖、乙酸銨、檸檬酸氫二銨各自組合,以不含上述3種碳源的MRS培養(yǎng)基為對(duì)照,研究對(duì)LactobacillusJ23發(fā)酵合成Bac-J23的影響,分析確定最優(yōu)碳源及其最佳濃度。1.3.2最佳碳源的確定對(duì)MRS中蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏各自組合,以不含上述3種有機(jī)氮源的MRS培養(yǎng)基為對(duì)照,37℃發(fā)酵24h,研究對(duì)Bac-J23合成和LactobacillusJ23生長(zhǎng)的影響,分析確定最優(yōu)碳源及其最佳濃度。1.3.3lactabacisj23的發(fā)酵合成分別對(duì)MRS培養(yǎng)基中其他組分(吐溫,MgSO4·7H2O,MnSO4·4H2O),研究其對(duì)LactobacillusJ23發(fā)酵合成Bac-J23的影響,分析確定最優(yōu)碳源及其最佳濃度。1.3.4指示菌最佳稀釋度采用瓊脂擴(kuò)散法,細(xì)菌素活力定義為用對(duì)指示菌觀察不到抑菌圈出現(xiàn)的最高稀釋度,其倒數(shù)為細(xì)菌素效價(jià)值(AU/mL),計(jì)算式為AU/mL=2n×(1000/x),x為細(xì)菌素加樣體積,n為對(duì)指示菌顯示抑菌圈的孔數(shù);1000為體積換算值。2結(jié)果與分析2.1合成bac-j23葡萄糖(A:20g/L)、檸檬酸氫二銨(B:2g/L)、乙酸鈉(C:5g/L)為MRS培養(yǎng)基的主要碳源。上述3種碳源及其各自組合對(duì)Bac-J23合成的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明,葡萄糖(20g/L)和檸檬酸氫二銨(2g/L)抑制了Bac-J23的合成;乙酸鈉(5g/L)對(duì)Bac-J23的合成具有刺激誘導(dǎo)作用,但合成誘導(dǎo)作用方式及機(jī)理還有待于進(jìn)一步深入研究。進(jìn)一步研究了其他有機(jī)碳源(葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、麥芽糖)對(duì)合成Bac-J23的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2。麥芽糖最有利于菌體生長(zhǎng),而蔗糖最有利于Bac-J23合成;Bac-J23的合成與菌體生長(zhǎng)進(jìn)程表現(xiàn)出不一致性。2.2培養(yǎng)基中主要氮源的確定蛋白胨(A:1%)、酵母提取物(B:0.5%)、牛肉膏(C:1%)、檸檬酸氫二銨(0.2%)為MRS培養(yǎng)基中的主要氮源。研究了上述幾種氮源及各自組合對(duì)Bac-J23發(fā)酵合成和菌體生長(zhǎng)的影響。從圖3可知,酵母提取物對(duì)菌體的生長(zhǎng)和Bac-J23的合成均最有利于,而蛋白胨沒(méi)有明顯效果,因此將牛肉膏和酵母提取物作為優(yōu)選氮源,從而簡(jiǎn)化了培養(yǎng)基組分。2.3kh2po4對(duì)bac-j23的合成影響從圖4可知,不同濃度的KH2PO4對(duì)Bac-J23合成和菌體生長(zhǎng)具有不同的影響。當(dāng)KH2PO4濃度大于5g/L時(shí),對(duì)菌體生長(zhǎng)不利;相對(duì)而言,KH2PO4(15g/L~20g/L)對(duì)Bac-J23的合成更有利,但當(dāng)KH2PO4高于20g/L時(shí),對(duì)菌體生長(zhǎng)和Bac-J23的合成均出現(xiàn)負(fù)面影響。VUYSTL等研究了KH2PO4對(duì)Nisin的合成影響,發(fā)現(xiàn)KH2PO4對(duì)Nisin合成和菌體生長(zhǎng)均有明顯的刺激作用。2.4bac-j23發(fā)酵條件對(duì)bac-j23發(fā)酵的影響MgSO4在MRS中的濃度一般為0.58g/L,考察了不同濃度MgSO4對(duì)Bac-J23發(fā)酵合成和菌體生長(zhǎng)的影響。從圖5可知,當(dāng)培養(yǎng)基中MgSO4為0.2g/L時(shí),對(duì)Bac-J23的合成最有利,而MgSO4濃度變化對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響不明顯。2.5mnso4對(duì)bac-j23生長(zhǎng)和菌體生長(zhǎng)的影響MRS中MnSO4的初始濃度為0.25g/L,研究了不同濃度的MnSO4對(duì)Bac-J23合成和菌體生長(zhǎng)的影響。從圖6可知,MnSO4對(duì)Bac-J23合成和菌體生長(zhǎng)都沒(méi)有明顯影響。2.6tween-80對(duì)bac-j23活性的影響MRS中Tween-80的初始濃度為0.1%,考察了不同濃度的Tween-80對(duì)Bac-J23合成和菌體生長(zhǎng)的影響。從圖7可知,Tween-80對(duì)LactobacillusJ23的生長(zhǎng)和Bac-J23的合成沒(méi)有明顯影響。當(dāng)Tween-80的濃度大于0.2%,對(duì)Bac-J23抗菌活性有負(fù)面影響,這可能是由于Tween-80與合成的Bac-J23結(jié)合形成了復(fù)合體,導(dǎo)致Bac-J23的活性降低或完全失去活性。液體培養(yǎng)基中Tween-80含量過(guò)高不利于Bac-J23的分純。3氮源中酵母提取物對(duì)bac-j23合成的影響研究了MRS培養(yǎng)基各組分對(duì)LactobacillusJ23發(fā)酵合成廣譜抗菌肽Bac-J23的影響。乙酸鈉對(duì)Bac-J23的合成具有誘導(dǎo)作用,外加有機(jī)碳源中蔗糖對(duì)Bac-J23合成最有利,氮源中酵母提取物對(duì)LactobacillusJ23的生長(zhǎng)和Bac-J23的合成均具有明顯的促進(jìn)作用,高濃度的KH2PO4比低濃度的KH2PO4更有利于Bac-J23的合成,MgSO4最適濃度為0.2g/L時(shí),而MnSO4和Tween-80對(duì)Ba