抗體依賴增強(qiáng)感染效應(yīng)在登革病毒致病機(jī)理中的應(yīng)用

病毒位于黃毒科，分為四種類型（denv-1、denv-2、denv-3和denv-4）。每個(gè)血清素組的同源性為65%70%。DENV主要通過(guò)埃及伊蚊(Aedesaegypti)和白紋伊蚊(Aedesalbopictus)等昆蟲媒介傳播。全球熱帶亞熱帶地區(qū)有25億人口面臨著被感染的危險(xiǎn)。據(jù)估計(jì),每年有5000萬(wàn)～10000萬(wàn)人被感染,其中50萬(wàn)人為嚴(yán)重感染,死亡人數(shù)約1.5萬(wàn)。人體初次感染DENV時(shí),可能只引起隱性感染而無(wú)登革熱的典型癥狀,并且可獲得對(duì)同型病毒的長(zhǎng)久免疫力。但四個(gè)血清型的DENV之間缺乏交叉免疫保護(hù)作用,人體二次感染其他型別的DENV時(shí)將易發(fā)生癥狀更為嚴(yán)重的登革出血熱(Denguehemorrhagicfever,DHF)和登革休克綜合征(Dengueshocksyndrome,DSS)。關(guān)于登革病毒二次感染引起更為嚴(yán)重疾病的機(jī)制目前尚未闡明,但大多數(shù)學(xué)者認(rèn)可Halstead等于1977年提出的抗體依賴增強(qiáng)感染效應(yīng)(Antibody-dependentenhancement,ADE)。即機(jī)體感染某一血清型的DENV后,當(dāng)機(jī)體再次感染其他血清型的DENV時(shí),由于抗體與異型病毒的親和力較低及其在體內(nèi)濃度的下降,不但無(wú)法中和病毒,反而會(huì)引起自身Fc段與體內(nèi)含有Fc受體的細(xì)胞表面結(jié)合,使得病毒在細(xì)胞表面聚集,增強(qiáng)了病毒對(duì)細(xì)胞的感染能力。在隨后的30多年中,開展了大量關(guān)于ADE的研究。1研究ade對(duì)細(xì)胞和動(dòng)物模型的影響1.1細(xì)胞系的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)很多原始細(xì)胞和細(xì)胞株均可以被DENV感染,其中有單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等。體外試驗(yàn)常用的細(xì)胞株有:K562細(xì)胞株(人類白血病細(xì)胞株,可表達(dá)FcγRⅡa、DC-SIGN,類似于成熟的樹突狀細(xì)胞)、THP-1細(xì)胞株(人類單核細(xì)胞傳代細(xì)胞系)、U937細(xì)胞株(人類單核細(xì)胞株)、人淋巴細(xì)胞瘤B細(xì)胞株、人原始單核細(xì)胞源性的巨噬細(xì)胞等。通過(guò)對(duì)不同類型的細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),能夠產(chǎn)生ADE的細(xì)胞需在其表面表達(dá)Fc受體,并證實(shí)人體內(nèi)可產(chǎn)生ADE的靶細(xì)胞為單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成熟的樹突狀細(xì)胞等。1.2denv感染小鼠模型建立小型動(dòng)物模型對(duì)于研究DENV感染是非常必要的,可用于宿主免疫機(jī)制、疾病病理、相關(guān)藥物和疫苗等方面的研究。在過(guò)去的幾十年里人們一直嘗試建立DENV感染的動(dòng)物模型,但是大部分動(dòng)物被證實(shí)對(duì)DENV感染有抵抗力。所以,到目前為止還沒(méi)有建立能夠完全反映重癥DENV感染時(shí)病情進(jìn)展的動(dòng)物模型。前已發(fā)現(xiàn)靈長(zhǎng)類動(dòng)物和小鼠體內(nèi)可發(fā)生ADE。近幾年多數(shù)學(xué)者致力于小鼠模型的建立。最初嘗試建立小鼠模型時(shí),需要高劑量的病毒,并且不能體現(xiàn)人體感染DENV過(guò)程中的病毒在外周組織中的復(fù)制、機(jī)體感染DENV出現(xiàn)ADE后特征性癥狀的演變等。后來(lái),人們發(fā)現(xiàn)免疫功能嚴(yán)重不全的小鼠可被DENV感染,例如:BALB/cnu/nu無(wú)胸腺裸鼠和RAG1-/-小鼠等,但其癥狀與人類不同,往往死于癱瘓而非人體出現(xiàn)的血管通透性改變。近年來(lái)建立小鼠模型的另一種方法是:人工將人外周血淋巴細(xì)胞或者對(duì)DENV敏感的腫瘤細(xì)胞植入小鼠體內(nèi),使其成為嚴(yán)重免疫缺陷小鼠,作為候選的DENV感染小鼠模型。例如,SCID小鼠即重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合癥(Severecombinedimmunedeficientdisease,SCID)小鼠,是由C.B-17近交系小鼠的16染色體的單個(gè)隱性突變基因所致。該小鼠由于T、B細(xì)胞功能均缺乏,對(duì)移植入其體內(nèi)的異種組織細(xì)胞排斥反應(yīng)較弱。將白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞移植入SCID小鼠后,制成了對(duì)登革病毒敏感的SCID-K562小鼠模型,可用來(lái)檢測(cè)不同血清型DENV的毒力以及抗體對(duì)DENV感染的保護(hù)作用。但由于SCID-K562小鼠免疫功能不健全,而免疫病理反應(yīng)是DHF、DSS的主要病因之一,導(dǎo)致SCID-K562小鼠作為DENV感染動(dòng)物模型存在一定的局限性。隨著此類人源化小鼠模型的發(fā)展,對(duì)已建立的非肥胖型糖尿病和嚴(yán)重免疫缺陷小鼠模型又重新進(jìn)行了探索,發(fā)現(xiàn)在DENV-2皮下注射時(shí),可重復(fù)人體感染時(shí)出現(xiàn)的病毒血癥。然而,由于人體和小鼠宿主本身免疫系統(tǒng)的差異以及此類人源化小鼠存在嚴(yán)重的免疫缺陷,有可能不能準(zhǔn)確體現(xiàn)人體感染DENV時(shí)免疫調(diào)節(jié)的變化,限制了對(duì)DENV感染時(shí)免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的研究。此外,這類小鼠來(lái)源少,花費(fèi)較高,這限制了大規(guī)模的應(yīng)用研究。隨著對(duì)干擾素(IFNs)研究的增多,尤其是在發(fā)現(xiàn)IFNs在控制病毒感染中起重要作用之后,越來(lái)越多的研究者開始關(guān)注IFNs及其受體的研究并用于動(dòng)物模型的建立。Johnson等最早建立了DENV感染的AG129小鼠模型。Shresta等通過(guò)比較發(fā)現(xiàn),敲除IFN-α/β受體基因及IFN-γ受體基因的小鼠更適合于研究早期DENV在外周組織中的復(fù)制和隨后的疾病發(fā)展。由于免疫缺陷的存在,AG129小鼠模型可用于DENV感染后的功能性免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)研究。四種血清型的DENV均可感染AG129小鼠,并且病毒可以在與人體相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞和組織中復(fù)制,在DENV感染時(shí)可表現(xiàn)出抗體保護(hù)作用和抗體增強(qiáng)作用。因此,此模型可以用來(lái)驗(yàn)證最初主要通過(guò)流行病學(xué)觀察得出的ADE假說(shuō),說(shuō)明體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果和體內(nèi)免疫功能調(diào)節(jié)系統(tǒng)的作用。隨后,Zellweger等通過(guò)被動(dòng)免疫AG129小鼠,研究分析了嬰兒發(fā)生DHF/DSS的機(jī)理,發(fā)現(xiàn)小鼠肝竇上皮細(xì)胞可產(chǎn)生ADE效應(yīng)。Balsitis等發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)致命性的抗體增強(qiáng)DENV感染可以被抗體變異體(E60-N297Q,不能結(jié)合Fcγ受體)阻斷。這兩項(xiàng)研究均證實(shí)了AG129小鼠作為研究DENV動(dòng)物模型的可行性。有可能是由于小鼠和人類細(xì)胞之間的差異,AG129小鼠模型仍不能完全重復(fù)人體感染DENV后的疾病發(fā)展過(guò)程。2ad-de效果的影響機(jī)制2.1血清型抗體與deBalsitis等在利用AG129小鼠研究重癥DENV感染作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn),腹腔注射抗病毒血清后的小鼠全身病毒量增加,表達(dá)Fcγ受體細(xì)胞的感染量增加,從而加重了病毒感染。其機(jī)制可能為當(dāng)機(jī)體再次感染某種血清型(與初次感染血清型不同)的DENV時(shí),由于體內(nèi)抗體濃度低于中和濃度,且對(duì)異型病毒的親和力較低,特異性的單克隆抗體不但無(wú)法中和病毒,反而可以形成感染性的免疫復(fù)合物與細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合,從而促進(jìn)病毒進(jìn)入細(xì)胞。Rothman進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),DENV二次感染與第一次血清型不同時(shí),具有交叉活性的抗體可介導(dǎo)嚴(yán)重的DENV感染;而兩次感染的DENV血清型相同時(shí),血清型特異性的抗體會(huì)保護(hù)機(jī)體免受同種病毒的再次感染。而Balsitis等還發(fā)現(xiàn),即便兩次感染的DENV血清型相同,在體內(nèi)特異性抗體濃度較低的情況下也會(huì)出現(xiàn)ADE現(xiàn)象。在另一個(gè)使用AG129小鼠模型的試驗(yàn)中,病毒-抗體復(fù)合物與Fcγ受體相互作用導(dǎo)致病毒水平升高,并且發(fā)現(xiàn)肝竇上皮細(xì)胞是小鼠體內(nèi)唯一表現(xiàn)出ADE的細(xì)胞。事實(shí)上,多次感染不同血清型DENV后造成ADE的情況更加常見(jiàn)。新生兒從母體得到多克隆抗體,同時(shí)由于體內(nèi)抗體濃度低于中和濃度,在初次感染登革病毒時(shí)即可出現(xiàn)嚴(yán)重的癥狀。近期Dejnirattisai等通過(guò)對(duì)抗非結(jié)構(gòu)蛋白1抗體、抗包膜蛋白抗體和抗前膜蛋白(precursor-membraneprotein,prM)抗體進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn),只有抗prM抗體在抗體低濃度和高濃度的情況下均產(chǎn)生ADE。繼而通過(guò)使用昆蟲卵巢SF9細(xì)胞株及人單核細(xì)胞對(duì)抗prM抗體的中和作用和增強(qiáng)感染作用進(jìn)行研究比較,推測(cè)病毒表面部分裂解的prM可減少病毒表面的可產(chǎn)生中和病毒抗體的抗原密度,使DENV在存在抗prM抗體時(shí)更容易產(chǎn)生ADE。最近通過(guò)對(duì)28名初次感染或者二次感染的患兒恢復(fù)期早期或晚期的外周血中特異性B細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),在初次感染時(shí),針對(duì)DENV包膜E蛋白的B細(xì)胞具有高度血清型特異性,而在二次感染過(guò)程中,大部分此類細(xì)胞則具有血清型交叉活性,并且分泌能中和不同血清型DENV的抗體。這些針對(duì)DENVprM和E蛋白抗體的新發(fā)現(xiàn)為今后ADE的研究提供了新思路。2.2denv感染后細(xì)胞的表達(dá)和免疫調(diào)節(jié)作用由上述研究可見(jiàn),在人體二次感染DENV時(shí),細(xì)胞表面的Fc受體或者是病毒包膜蛋白可能通過(guò)促進(jìn)病毒進(jìn)入細(xì)胞產(chǎn)生ADE效應(yīng)。此外,有研究發(fā)現(xiàn)AG129小鼠發(fā)生ADE時(shí)會(huì)引起血管通透性增加,血小板減少,血細(xì)胞比容增加,導(dǎo)致以胃腸道出血、早期死亡為特征的嚴(yán)重疾病。與此同時(shí),小鼠體內(nèi)病毒載量增大,細(xì)胞因子濃度也發(fā)生變化。Vaughn等發(fā)現(xiàn)患兒胸水產(chǎn)生量占胸腔的體積百分率與病毒載量峰值變化一致,說(shuō)明血管通透性的改變與病毒載量的變化相一致。同時(shí)發(fā)現(xiàn),初次感染DENV的患兒與二次感染的患兒相比,雖然后者病毒載量高,但病毒血癥持續(xù)時(shí)間短,可見(jiàn)體內(nèi)存在抗體時(shí),機(jī)體通過(guò)免疫反應(yīng)可迅速清除病毒。在迅速清除病毒的同時(shí),胸水產(chǎn)生量占胸腔體積百分率明顯高于初次感染,病情較初次感染重,可見(jiàn)在DENV二次感染時(shí)血管通透性的改變主要是由于宿主的免疫反應(yīng)引起的,而并非病毒直接造成的損傷,宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)的改變則主要體現(xiàn)在細(xì)胞因子濃度的變化上。有研究發(fā)現(xiàn)DENV感染后維甲酸誘導(dǎo)基因-I(Retinoicacid-induciblegene-I,RIG-I)、黑色素瘤分化相關(guān)基因5(Melanomadifferentiationassociatedgene5,MDA-5)、IFN-β表達(dá)上調(diào),但是在被DENV感染發(fā)生ADE的細(xì)胞中,這些蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)被抑制。同時(shí),在上述細(xì)胞中,IL-10和細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子3(Suppressorofcytokinesignaling3,SOCS3)的表達(dá)大幅度上升。并發(fā)現(xiàn)與輕度登革熱患者相比,登革出血熱患者的外周血單核細(xì)胞(PBMCs)當(dāng)中RIG-I、MDA-5和IFN-β的水平降低,而IL-10和SOCS3升高。在發(fā)生ADE時(shí),IL-10的抑制作用早已被證實(shí),使產(chǎn)生ADE的THP-1細(xì)胞分泌低濃度的Ⅰ型干擾素(INF-α/β),從而抑制了IL-12、INF-γ、腫瘤壞死因子(Tumornecrosisfactor,TNF)的轉(zhuǎn)錄和翻譯,促進(jìn)了抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌。Rolph等在使用原始人單核細(xì)胞源性的巨噬細(xì)胞進(jìn)行研究時(shí)得到了不同的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞被感染產(chǎn)生ADE時(shí),IFN-β水平降低,SOCS3上調(diào),而IL-10、細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子1(Suppressorofcytokinesignaling1,SOCS1)、RIG-I、MDA-5的表達(dá)沒(méi)有任何變化,同時(shí)IL-6顯著升高。而IL-6信號(hào)與SOCS3的激活有關(guān),這為DENV感染后發(fā)生ADE提供了另一種可能的機(jī)制,即被DENV感染產(chǎn)生ADE的巨噬細(xì)胞中IL-6通過(guò)SOCS3抑制抗病毒反應(yīng)。兩次實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)Ⅰ型干擾素(INF-α/β)濃度降低,抑制了IL-12、INF-γ,TNF的轉(zhuǎn)錄和翻譯,同時(shí)促進(jìn)了抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌。此外,當(dāng)細(xì)胞感染DENV產(chǎn)生ADE后,可通過(guò)破壞一氧化氮合酶基因轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄,阻斷轉(zhuǎn)錄信號(hào)傳導(dǎo)子與激活子1(Signaltransducersandactivationoftranscription1,STAT-1)抑制固有的抗DENV介質(zhì)/一氧化氮自由基。二次感染DENV發(fā)生ADE作用時(shí),體內(nèi)不僅有白介素濃度的變化,INF及INF誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。發(fā)生DHF后存活的患者體內(nèi)血液中INF-β濃度比死亡患者高。對(duì)小鼠模型和登革熱患者的研究均發(fā)現(xiàn),在癥狀輕微時(shí),體內(nèi)大量的INF及INF誘導(dǎo)產(chǎn)生的因子在控制DENV感染時(shí)起到了保護(hù)作用。登革熱患者體內(nèi)PBMCs中γ-干擾素誘導(dǎo)蛋白10(Interferongamma-inducedprotein10,IP-10/CXCL10)明顯升高,在一個(gè)小鼠模型中,IP-10作為自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞的化學(xué)引物,阻斷DENV與其受體的相互作用保護(hù)機(jī)體。分析感染DENV患者的血清時(shí)發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞趨化蛋白2(Monocytechemotacticprotein2,MCP-2/CCL8)在感染發(fā)熱期和發(fā)熱后期均顯著升高。最近研究發(fā)現(xiàn),DENV二次感染發(fā)生ADE效應(yīng)還與TOLL樣受體有關(guān)。DENV感染恒河猴后,聯(lián)合刺激TOLL樣受體3(Toll-LikeReceptor3,TLR3)與TLR7/8可以減少病毒復(fù)制,并且增強(qiáng)體內(nèi)的抗病毒免疫反應(yīng)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)DENV可以抵消TLR激動(dòng)劑激活骨髓樹突狀細(xì)胞(Myeloiddendriticcells,mDC)活化和產(chǎn)生IP-10的作用。因此,ADE不僅促進(jìn)病毒進(jìn)入細(xì)胞,而且增強(qiáng)病毒細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,調(diào)節(jié)固有和可調(diào)節(jié)性細(xì)胞內(nèi)抗病毒機(jī)制。3ade效應(yīng)在臨床上的應(yīng)用研究ADE效應(yīng)存在于多種病毒的感染過(guò)