大鼠延髓背角定向fos陽(yáng)性神經(jīng)元與氨基丁酸陽(yáng)性終末的關(guān)系

延髓背角（mdh）（也被稱(chēng)為三叉神經(jīng)脊束核心的后端亞核）是通過(guò)面口部損傷刺激信息傳遞給中樞神經(jīng)的初始大門(mén)。損傷感神經(jīng)的無(wú)髓和薄髓的初始傳遞給纖維，損傷刺激信息通過(guò)大腦和手臂邊緣的核心（pbn）傳輸。γ-氨基丁酸(GABA)和甘氨酸(Gly)是神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制性遞質(zhì),GABA和Gly陽(yáng)性神經(jīng)元、纖維以及它們的受體密集地分布于MDH淺層(Ⅰ和Ⅱ?qū)?,在傷害性信息調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。Fos蛋白是原癌基因c-fos激活后的表達(dá)產(chǎn)物,可作為研究傷害性信息傳導(dǎo)通路的標(biāo)識(shí)物。為了深入探討GABA和Gly對(duì)面口部傷害性信息傳遞的調(diào)控機(jī)制,本研究用激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察了GABA和Gly陽(yáng)性終末與大鼠MDH內(nèi)接收面口部傷害性信息并向丘腦或臂旁核投射神經(jīng)元間的聯(lián)系。間腦、腦橋和延髓的組織學(xué)觀察SD大鼠21只,雌雄不拘,體重280～300g,戊巴比妥鈉(40mg/kg)經(jīng)腹腔麻醉后開(kāi)顱,將0.1～0.3μl的10%四甲基羅達(dá)明(tetramethylrhodamine,TMR)注入一側(cè)丘腦(n=10)或臂旁核(n=11)。術(shù)后將動(dòng)物飼養(yǎng)在安靜、避強(qiáng)光、溫暖的環(huán)境中;3～5d后經(jīng)乙醚吸入麻醉,雙側(cè)口周皮下各注射100μl的5%福爾馬林溶液,于原環(huán)境中繼續(xù)存活2h;動(dòng)物在深麻下開(kāi)胸,經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈,先以100ml生理鹽水沖洗血液,再用含4%多聚甲醛、0.75%戊二醛和2%苦味酸的0.1mol/L磷酸緩沖液(PB,pH7.4)灌注固定,持續(xù)30min以上。灌注完畢立即取腦并置入上述新鮮固定液中后固定4～6h,再移入含30%蔗糖的PB中直至沉底(4℃)。冰凍冠狀切間腦、腦橋和延髓,片厚30μm。間腦和腦橋切片隔1張取1張,分2套收集;延髓切片隔4張取1張,分5套收集于0.01mol/L的PBS(pH7.4)中。間腦、腦橋和延髓的第1套切片裱片后用于注射區(qū)和TMR標(biāo)記神經(jīng)元的觀察,第2套切片裱片后用于Nissl染色。延髓的第3、4套切片分別在室溫下用于TMR/GABA/Fos或TMR/Gly/Fos的免疫熒光三重染色,主要步驟如下:1.第3套切片用兔抗TMR血清(1∶3000,日本京都大學(xué)Kaneko教授惠贈(zèng))/豚鼠抗GABA血清(1∶1000,Chemicon)/山羊抗Fos血清(1∶1000,Chemicon)混合液孵育24h;第4套切片用豚鼠抗TMR血清(1∶3000,日本京都大學(xué)Kaneko教授惠贈(zèng))/兔抗Gly血清(1∶1000;Chemicon)/山羊抗Fos血清(1∶1000;Chemicon)混合液孵育24h;2.第3、4套切片分別用10mg/Lbiotin結(jié)合的驢抗豚鼠IgG(Chemicon)或10mg/Lbiotin結(jié)合的驢抗兔IgG孵育3h;3.第3套切片用10mg/LTMR標(biāo)記的驢抗兔IgG(Chemicon)、10mg/LCy5-avidin(Vector)和10mg/LFITC標(biāo)記的驢抗山羊IgG(Jackson)混合液孵育4h;第4套切片用10mg/LTMR標(biāo)記的驢抗豚鼠IgG(Cemicon)、10mg/LCy5-avidin(Vector)和FITC標(biāo)記的驢抗山羊IgG(Chemicon)混合液孵育4h。各步驟間以PBS洗片3次,每次10min。切片裱于清潔的載玻片上,避光干燥,甘油和PBS混合液封片,激光共聚焦掃描顯微鏡(LSM410;Zeiss)觀察。用正常豚鼠、兔和山羊血清的混合液代替一抗孵育第5套切片,進(jìn)行對(duì)照染色,結(jié)果為陰性。fos陽(yáng)性神經(jīng)元TMR注入一側(cè)丘腦或臂旁核后,在雙側(cè)MDH的Ⅰ～Ⅲ層內(nèi)可見(jiàn)紅色的TMR逆標(biāo)神經(jīng)元,它們主要集中在Ⅰ層和Ⅱ?qū)油鈧?cè)部(Ⅱo)(圖1a～d中雙三角及1b中單箭頭所示神經(jīng)元)。在將TMR注入丘腦或臂旁核后,雖然逆標(biāo)神經(jīng)元見(jiàn)于雙側(cè)MDH,但分別以注射區(qū)的同側(cè)或?qū)?cè)為主。Ⅰ層內(nèi)的逆標(biāo)神經(jīng)元胞體多為中型(20～35μm)梭形、橢圓形或三角形,其突起大都在本層內(nèi)延伸,偶有伸向Ⅱ?qū)踊蛏顚诱?Ⅱo可見(jiàn)少量小型(≤20μm)梭形和三角形逆標(biāo)神經(jīng)元;Ⅲ層內(nèi)的逆標(biāo)神經(jīng)元較少,胞體多呈大型(≥36μm)或中型梭形、橢圓形和三角形,其樹(shù)突常伸向Ⅰ層和Ⅱo。MDH內(nèi)向臂旁核投射的神經(jīng)元明顯多于向丘腦投射的神經(jīng)元。綠色的Fos陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物見(jiàn)于胞核。Fos陽(yáng)性神經(jīng)元主要分布于MDH的Ⅰ層和Ⅱ?qū)?Ⅲ層內(nèi)僅見(jiàn)少量散在分布的Fos陽(yáng)性神經(jīng)元(圖1中單三角所示神經(jīng)元)。藍(lán)色的GABA陽(yáng)性終末(圖1a,a′;1b,b′)和藍(lán)色的Gly陽(yáng)性終末(圖1c,c′;1d,d′)主要位于延髓背角淺層,且Ⅱ?qū)佣嘤冖駥雍廷髮印Ｔ诩す夤簿劢癸@微鏡下觀察到MDH內(nèi)向丘腦或臂旁核投射的部分紅色TMR逆標(biāo)神經(jīng)元的胞核呈綠色的Fos陽(yáng)性(圖1中雙三角所示神經(jīng)元)。藍(lán)色的GABA或Gly陽(yáng)性終末與部分向丘腦或臂旁核投射的Fos陽(yáng)性神經(jīng)元的胞體形成密切接觸(圖1a′～d′中單箭頭所示部位)。gaba和gly陽(yáng)性終末與脊丘系神經(jīng)元/傳導(dǎo)束MDH淺層是傳遞面口部傷害性信息的中繼站,在面口部傷害性信息的傳遞和調(diào)控方面發(fā)揮著重要的作用。丘腦內(nèi)接受面口部傷害性刺激信息的特異性核團(tuán)是腹后內(nèi)側(cè)核(VPM)。以往的研究表明臂旁核也接受同側(cè)MDH和脊髓背角淺層的上行投射。將福爾馬林注入大鼠面口部的皮下所致的傷害性刺激可以激活MDH淺層的傷害性感受神經(jīng)元并表達(dá)Fos蛋白;MDH內(nèi)的Fos陽(yáng)性神經(jīng)元不但向丘腦投射,而且向臂旁核投射,向臂旁核投射的Fos陽(yáng)性神經(jīng)元明顯多于向丘腦投射的Fos陽(yáng)性神經(jīng)元。在大鼠MDH,GABA能終末主要分布于Ⅰ層和Ⅱ?qū)?。Gly能終末也主要集中于Ⅱ?qū)?Ⅰ層和Ⅲ層的陽(yáng)性終末較少。本研究在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察到GABA或Gly陽(yáng)性終末與向丘腦或臂旁核投射的面口部傷害性感受神經(jīng)元之間形成密切接觸,提示GABA和Gly在面口部傷害性信息傳遞的調(diào)控方面發(fā)揮著重要的作用。外周的傷害性信息在經(jīng)過(guò)延髓和脊髓背角向高級(jí)中樞傳遞的同時(shí),也經(jīng)過(guò)延髓和脊髓背角內(nèi)的抑制性局部環(huán)路進(jìn)行整合。有證據(jù)表明GABA和Gly可在脊髓背角誘發(fā)出抑制性突觸后電流(IPSP)。GABA和Gly不僅可以抑制大鼠脊髓背角的中間神經(jīng)元,而且能抑制脊丘系神經(jīng)元的活動(dòng)。已有人觀察到GABA和Gly能終末與脊丘系神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系。但上述結(jié)果未能準(zhǔn)確地闡明GABA和Gly所抑制的投射神經(jīng)元的性質(zhì),即沒(méi)有說(shuō)明GABA和Gly所抑制的神經(jīng)元是否參與了外周傷害性刺激信息的感受。本研究用免疫熒光三重染色標(biāo)記技術(shù)在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察的結(jié)果,為GABA和Gly抑制MDH內(nèi)向丘腦或臂旁核投射的傷害性感受神經(jīng)元的機(jī)能活動(dòng)的結(jié)論,提供了直接的形態(tài)學(xué)依據(jù)。我們以往的形態(tài)學(xué)研究表明主要傳遞傷害性信息的P物質(zhì)(SP)