活血化瘀法對(duì)早期實(shí)驗(yàn)性骨折愈合動(dòng)物模型骨折斷端vegf、bmp-2表達(dá)的影響

骨折早期修復(fù)性細(xì)胞因子的克隆和活性是骨折愈合的關(guān)鍵。Frost認(rèn)為許多骨不連或延遲愈合的問(wèn)題就出現(xiàn)在骨愈合的早期,骨折后局部瘀血是影響骨折愈合的主要因素。有基礎(chǔ)研究表明,參與骨折愈合的各種修復(fù)性細(xì)胞因子的增殖主要在早期約14d以內(nèi)完成,相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)對(duì)骨折愈合三期分法中的早期。此期治療以活血化瘀藥物為主。因此研究活血化瘀方藥對(duì)骨折早期修復(fù)性細(xì)胞因子的增殖和調(diào)控作用對(duì)探索中藥促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制有著非常重要的意義。基于上述原因,我們建立了骨折動(dòng)物模型。1材料和方法1.1醫(yī)用非織造材料,醫(yī)用器械大鼠BMP-2及VEGF試劑盒(即用型)武漢博士德生物有限公司提供。BH-2型光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司),切片機(jī)(上海醫(yī)療器械四廠),HC-TP12B-1型天平(北京醫(yī)用天平廠),DHG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司生產(chǎn)),微量可調(diào)加樣器:1ml,50μl,200μl;外科常用器械(由陜西中醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)。自購(gòu)鋼鋸條(螺旋測(cè)微器測(cè)鋸齒厚度1mm,使用前高壓蒸汽消毒使之保持無(wú)菌)。1.2尾酒各3g自煎復(fù)元活血湯。處方組成:柴胡、天花粉、當(dāng)歸尾各15g,穿山甲10g,酒大黃、酒桃仁各30g,紅花6g。用傳統(tǒng)煎藥方法,制成含生藥量為2g/ml,備用。1.3術(shù)后處理和給藥造模方法:以10%水合氯醛按0.3ml/100g腹腔麻醉大鼠,麻醉顯效后左前臂剝毛、消毒,并切開(kāi)皮膚肌肉,用特制咬骨鉗將橈骨中段造成1mm的骨缺損,然后逐層縫合,不做固定。術(shù)后進(jìn)行3d抗感染治療,給予慶大霉素4萬(wàn)單位肌肉注射1次/d。術(shù)后A組空白組,B組給予生理鹽水,C組給予復(fù)元活血。用傳統(tǒng)煎藥方法,制成含生藥量為2g/ml,按“動(dòng)物與人體的千克體重劑量折算系數(shù)表”折算成等效劑量,按2ml/100g胃,從造模后第1天開(kāi)始,每日一次,直至動(dòng)物處死。2常規(guī)he染色及bmp-2染色分別于造模后第3、7、10、14天,分4次處死大鼠,以骨折斷端為中心上、下0.5cm取材。取材后標(biāo)本置入濃度為40g/l的多聚甲醛固定24h,以濃度為100g/l的乙二胺四乙酸鈉(EDTA-2Na)脫鈣1~3周,石蠟切片厚5μm。分別進(jìn)行常規(guī)HE染色和BMP-2的免疫組化染色。所得免疫組化切片,用Biomias99圖像分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行圖像處理。2.1骨髓厚度測(cè)定細(xì)胞漿染色成紅色,細(xì)胞核染色成藍(lán)色,鏡下觀察骨痂形態(tài)。HE切片光鏡下測(cè)定,骨組織的厚度在100倍鏡下,每張切片以骨折缺損為中心選取10個(gè)視野,用目鏡測(cè)微尺測(cè)量骨痂厚度并計(jì)算平均值。所得數(shù)據(jù)用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2.2小鼠骨髓內(nèi)pbs和u-bmp-2-dba的檢測(cè)采用卵白素-生物素復(fù)合技術(shù)(ABC),具體步驟如下:組織固定,切片常規(guī)脫蠟至水;3%H202室溫孵育8min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,后蒸餾水洗3次,每次2min;熱修復(fù)抗原:將切片浸入0.01枸櫞酸鹽緩沖液(PH6.0),電爐加熱至沸騰后斷電,自然降溫至室溫,反復(fù)1次,冷卻后PBS洗滌2次;滴加5%BSA封閉液。室溫孵育20分鐘后甩去多余液體,不洗;BMP-2抗體濃縮液1:50稀釋,組織切片上滴加一抗稀釋液,濕盒37℃2h后PBS液洗3次,每次2min;添加生物素化山羊抗小鼠IgG,37℃孵育20min后PBS洗2min×3次;滴加即用型SABC試劑,37℃孵育20h后PBS洗3次,每次5min;DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒(AR1022),室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時(shí)間。蘇木素輕度復(fù)染。切片依次脫水、透明、封片。結(jié)果判定:實(shí)驗(yàn)均以PBS代替一抗為陰性對(duì)照。正常骨組織VEGF-DBA及BMP-2-DBA染色為陰性,而骨痂的染色為陽(yáng)性。染色劑主要在骨小梁以及成骨細(xì)胞中著色,細(xì)胞漿呈棕黃色改變,細(xì)胞核呈淡藍(lán)色改變。陽(yáng)性為棕黃色顆粒,著色深者為強(qiáng)陽(yáng)性。著色淺者表達(dá)弱陽(yáng)性。無(wú)著色顆粒為陰性。骨切片在400倍條件下每張切片隨機(jī)選擇100個(gè)成骨細(xì)胞和100個(gè)破骨細(xì)胞,計(jì)數(shù)其陽(yáng)性百分率。細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色染色陽(yáng)性物質(zhì)時(shí)為陽(yáng)性細(xì)胞。3結(jié)果與分析3.1骨創(chuàng)傷厚度測(cè)量3.2cagf-dap顯示3.3bmp-2-daa的顯色計(jì)數(shù)4骨瘤厚度和血清vegf及bmp-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)造模后第3天,模型組和復(fù)元活血湯組在骨痂厚度上無(wú)明顯差異(P>0.05);造模后第7、10、14天模型組和復(fù)元活血湯組在骨痂厚度上有極顯著性差異(P<0.01)。造模后第3天,模型組和活血化瘀組標(biāo)本在鏡下的VEGF及BMP-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異(P>0.05);造模后第7天,模型組和活血化瘀組標(biāo)本在鏡下的VEGF及BMP-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有明顯差異(P<0.05);10、14d模型組和復(fù)元活血湯組標(biāo)本在鏡下的VEGF及BMP-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有極顯著性差異(P<0.01)。5各組小鼠骨髓內(nèi)vegf及bmp-2表達(dá)的比較模型組和復(fù)元活血湯組在造模第7、10、14天骨痂厚度有極顯著差異(P<0.01),證實(shí)復(fù)元活血湯組軟骨骨痂生成量多,加快骨小梁的增生及向編織骨的轉(zhuǎn)化過(guò)程,從而加速了骨的愈合過(guò)程。在造模初期,模型組和復(fù)元活血湯組在VEGF及BMP-2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)上無(wú)明顯差異(P>0.05),但在造模第10、14天時(shí),細(xì)胞漿呈棕黃色,細(xì)胞核呈淡藍(lán)色的VEGF及BMP-2陽(yáng)性細(xì)胞明顯高于模型組(P<0.01)。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)證明在早期運(yùn)用復(fù)元活血湯治療骨折模型,造模后兩周內(nèi)的4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)觀察模型組和復(fù)元活血湯組在VEGF及BMP-2的表達(dá)及骨痂形態(tài)學(xué)上有明顯差異。即復(fù)元活血湯組在VEGF及BMP-2的表達(dá)強(qiáng)度及骨痂厚度上均優(yōu)于模型組,結(jié)